蔡昕添 張德蓮 畢云偉 洪 靜 吳 婷 楊順?lè)?李南方

抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic antibodies， ANCA)相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)是一組自身免疫性疾病，其特征為全身小血管的炎癥與壞死以及全身循環(huán)中自身抗體ANCA的高度表達(dá)[1]。AAV臨床表現(xiàn)雖復(fù)雜多變，但50%～80%的患者以急性腎衰竭為首發(fā)表現(xiàn)[2]。此外，早期診斷監(jiān)測(cè)難度大、病情進(jìn)展迅速、病死率高、預(yù)后極差均為AAV所致急性腎衰竭的重要特征[1，2]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，腎臟雖是AAV最易受累的臟器之一，但遺傳易感性在其發(fā)病中扮演了極其重要的角色[3]。因此，探究AAV腎損害發(fā)生、發(fā)展相關(guān)遺傳分子機(jī)制，對(duì)其早期診斷、監(jiān)測(cè)和發(fā)掘新的特異性治療靶點(diǎn)，從而改善患者預(yù)后具有重要意義。

本研究通過(guò)挖掘GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中AAV合并腎損害相關(guān)的基因芯片集，并通過(guò)R軟件篩選差異基因，利用一系列生物信息學(xué)技術(shù)篩選、驗(yàn)證核心基因，最終實(shí)現(xiàn)在遺傳基因組層面深入探究AAV合并腎損害的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制、挖掘潛在生物學(xué)標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。

材料與方法

1.基因芯片數(shù)據(jù)的獲?。涸诒狙芯恐兴骄康幕蛭㈥嚵袛?shù)據(jù)集檢索自NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，以如下檢索式進(jìn)行檢索(“antibodies, antineutrophil cytoplasmic”[MeSH Terms] OR ANCA[All Fields]) AND “Homo sapiens”[porgn] AND (“gse”[Filter] AND “attribute name tissue”[Filter])，最終獲得由Grayson等[4]所提交的基于GPL19983平臺(tái)(Affymetrix Human Gene 2.1 ST Array [HuGene21st_Hs_ENTREZG_19.0.0])的GSE108109和GSE108113芯片數(shù)據(jù)。GSE108109與GSE108113芯片均采用腎臟活檢組織作為研究樣本，其中GSE108109芯片作為發(fā)現(xiàn)組，共納入21例研究者，包括健康對(duì)照組6例和AAV合并腎損害患者15例。而GSE108113芯片作為驗(yàn)證組，共納入62例研究者，包括健康對(duì)照組5例和AAV合并腎損害患者57例。

2.數(shù)據(jù)處理與差異基因的篩選：基于R語(yǔ)言環(huán)境下使用Limma包對(duì)芯片數(shù)據(jù)補(bǔ)全缺失值，進(jìn)行背景校正和歸一化處理。最后構(gòu)建比對(duì)模型并篩選差異基因(differentially expressed genes，DEGs)，其篩選標(biāo)準(zhǔn)需同時(shí)滿足以下兩點(diǎn)：①|(zhì)logFC|≥2；②矯正后P<0.05。使用Ggplot2包繪制DEGs火山圖。

3.蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心基因的選擇：通過(guò)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)進(jìn)一步挖掘核心基因。將之前篩選出來(lái)的DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，相互作用可信度≥0.7者則認(rèn)為其PPI之間關(guān)系作用顯著。利用Cytoscape軟件(3.7.1版)將從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得的相互作用關(guān)系繪制成圖。利用分子復(fù)合檢測(cè)算法插件(MCODE)對(duì)基于已知PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因進(jìn)行評(píng)估，選擇得分最高的MCODE模塊[5]。

4.核心基因的驗(yàn)證：利用GSE108113芯片中的數(shù)據(jù)對(duì)篩選出的核心基因在AAV腎損害患者腎臟組織和健康成年人腎臟組織中的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。使用t檢驗(yàn)(對(duì)于正態(tài)分布的數(shù)據(jù))或非參數(shù)檢驗(yàn)(對(duì)于非正態(tài)分布的數(shù)據(jù))評(píng)估各組之間定量參數(shù)的差異。對(duì)表達(dá)存在顯著差異的基因繪制ROC曲線，并分別計(jì)算曲線下面積(AUC)。使用GraphPad Prism 6.1軟件與R軟件中的pROC包構(gòu)建圖表。

結(jié) 果

1.數(shù)據(jù)處理與差異基因的篩選結(jié)果：使用R軟件對(duì)GSE108109芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和歸一化處理。并利用比對(duì)模型初步篩選，發(fā)現(xiàn)GSE108109芯片共有187個(gè)表達(dá)改變顯著的DEGs，含35個(gè)上調(diào)基因，152個(gè)下調(diào)基因，并使用R語(yǔ)言軟件(3.5.3版)繪制了關(guān)于GSE108109芯片DEGs表達(dá)的火山圖(圖1)。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖 紅色.顯著上調(diào)基因；藍(lán)色.顯著下調(diào)基因；黑色.無(wú)顯著意義基因

2.蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心基因的選擇：為進(jìn)一步明確與AAV腎損害致病相關(guān)最核心的關(guān)鍵基因，筆者選擇了蛋白間相互作用可信度評(píng)分≥0.7的蛋白-蛋白節(jié)點(diǎn)。使用Cytoscape軟件將互不相連的節(jié)點(diǎn)去除，繪制出最終的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖2A)。使用MCODE插件對(duì)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了模塊化分析，根據(jù)MCODE聚類(lèi)條件篩選出得分最高的MCODE模塊(圖2B)。MCODE模塊化分析后共獲得9個(gè)關(guān)鍵基因，即CD53、C1QC、TYROBP、CSF1R、CYBB、LAPTM5、FCER1G、CTSS和C3AR1。該模塊中所包含的基因在整個(gè)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中相較于其他基因而言存在著更強(qiáng)的相互作用關(guān)系，因此相對(duì)于其他基因而言它們?cè)贏AV腎損害的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著更加決定性的作用。

圖2 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖 A.所有差異基因的網(wǎng)絡(luò)圖(紅色菱形模塊代表表達(dá)上調(diào)蛋白； 綠色六邊形模塊代表表達(dá)下調(diào)蛋白)；B. 通過(guò)MCODE聚類(lèi) 條件獲得的9個(gè)關(guān)鍵基因

3.核心基因的驗(yàn)證：利用GSE108113芯片中的數(shù)據(jù)對(duì)篩選出的核心基因在AAV腎損害患者腎臟組織和健康成年人腎臟組織中的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，并將驗(yàn)證結(jié)果用散點(diǎn)圖的形式展示，詳見(jiàn)圖3。在GSE108113芯片中有57例AAV合并腎損害患者樣本和5例健康成年人腎臟活組織樣本。與健康成年人腎臟活組織樣本比較，CD53、C1QC、TYROBP、CSF1R、CYBB、LAPTM5、FCER1G、CTSS在AAV合并腎損害患者樣本中表達(dá)顯著上調(diào)，這與GSE108109芯片分析的結(jié)果一致，但GSE108113芯片中C3AR1基因在AAV合并腎損害患者樣本與健康成年人腎臟活組織樣本間的表達(dá)并無(wú)顯著差異。以存在AAV合并腎損害作為結(jié)果變量，以CD53、C1QC、TYROBP、CSF1R、CYBB、LAPTM5、FCER1G和CTSS基因檢測(cè)表達(dá)量為診斷AAV合并腎損害的檢驗(yàn)變量。CD53基因的AUC值為0.837，C1QC基因的AUC值為0.919，TYROBP基因的AUC值為0.856，CSF1R基因的AUC值為0.783，CYBB基因的AUC值為0.784，LAPTM5基因的AUC值為0.922，F(xiàn)CER1G基因的AUC值為0.735，CTSS基因的AUC值為0.905，詳見(jiàn)圖4。

圖3 驗(yàn)證核心基因表達(dá)水平 *P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

圖4 各基因診斷AAV合并腎損害的ROC曲線

討 論

AAV是由自身免疫性抗體ANCA所誘導(dǎo)的全身小血管壞死性炎癥，常同時(shí)累及全身多個(gè)器官系統(tǒng)[6]。其中腎臟是AAV患者最常累及的器官，腎臟受累患者病情多進(jìn)展迅速，當(dāng)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時(shí)往往已進(jìn)展為不可逆的終末期腎病[7]。因此，提高AAV合并腎損害的早期篩查、診斷率，及時(shí)監(jiān)測(cè)病情活動(dòng)度并積極進(jìn)行針對(duì)性的靶向治療對(duì)提高AAV合并腎損害患者人腎存活率、改善長(zhǎng)期預(yù)后具有極為重要的意義。

本研究通過(guò)分析GSE108109芯片數(shù)據(jù)集,篩選得到187個(gè)差異表達(dá)基因,其中35個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào),152個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。通過(guò)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析并篩選得到以下核心基因：CD53、C1QC、TYROBP、CSF1R、CYBB、LAPTM5、FCER1G、CTSS和C3AR1。驗(yàn)證上述核心基因在AAV腎損害患者腎臟組織的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)CD53、C1QC、TYROBP、CSF1R、CYBB、LAPTM5、FCER1G、CTSS表達(dá)顯著增高。

CD53是一種蛋白質(zhì)編碼基因，該基因所編碼的蛋白質(zhì)屬于四跨膜蛋白家族[8]。有研究發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)能與整聯(lián)蛋白復(fù)合為細(xì)胞表面糖蛋白且可參與介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，在T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)CD2產(chǎn)生的信號(hào)[9]。C1QC基因編碼血清補(bǔ)體亞成分C1q的C鏈多肽，其所編碼蛋白C1qC是C1q的一個(gè)亞基，C1q主要是由體內(nèi)組織中的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分泌，在血液和組織中表達(dá)[10]。C1q的膠原蛋白樣區(qū)域與鈣離子所依賴(lài)的C1r與C1s酶復(fù)合物相互作用活化C1，這是血清補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑激活的起始步驟[11]。然后進(jìn)一步激活C3、C4等經(jīng)典途徑的下游成分，誘導(dǎo)免疫復(fù)合物所介導(dǎo)的細(xì)菌殺傷和提高吞噬作用。目前已有研究證實(shí)，C1q的異常激活與系統(tǒng)性紅斑狼瘡和膜增生性腎小球腎炎的發(fā)病密切相關(guān)[12]。

TYROBP曾用名DAP12和KARAP，該基因主要負(fù)責(zé)編碼跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽(酪氨酸激酶結(jié)合蛋白)。TYROBP可與NK細(xì)胞受體如KIR2DS2、KLRD1/KLRC2異源二聚體共同介導(dǎo)NK細(xì)胞的活化，還能促進(jìn)NK細(xì)胞受體KIR2DS1、KIR2DS2和KIR2DS4的轉(zhuǎn)運(yùn)和表面表達(dá)，并確保其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定性，增強(qiáng)并維持NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[13]。TYROBP可與SIRPB-1、TREM-1結(jié)合，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等髓系細(xì)胞的激活和介導(dǎo)趨化因子受體CCR7的上調(diào)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒進(jìn)程[14]。集落刺激因子1受體(CSF1R)，又稱(chēng)巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體和CD115，是由CSF1R基因編碼的一種細(xì)胞表面蛋白。CSF1R是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞功能的重要受體，通過(guò)CSF1R發(fā)出的細(xì)胞信號(hào)(CSF-1或IL-34)對(duì)于巨噬細(xì)胞的發(fā)育、存活、遷移和增殖至關(guān)重要[15]。

多項(xiàng)研究表明，CSF-1在血清和尿液中都是AAV合并腎損害疾病活動(dòng)的可靠生物學(xué)標(biāo)志物[16]。CYBB基因主要編碼細(xì)胞色素B-245重鏈，已有報(bào)道指出細(xì)胞色素B-245重鏈?zhǔn)峭淌杉?xì)胞氧化酶系統(tǒng)的主要成分。CYBB基因的異常表達(dá)可導(dǎo)致吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶的活性降低，活性降低后吞噬細(xì)胞仍然能夠吞噬細(xì)菌，但不能在吞噬囊泡中殺死細(xì)菌。目前已知與CYBB基因異常表達(dá)相關(guān)的疾病主要有慢性肉芽腫性疾病[17]。LAPTM5是一種在免疫細(xì)胞中獲得優(yōu)先表達(dá)的基因，它與泛素連接酶的Nedd4家族相互作用。最近在T細(xì)胞和B細(xì)胞中的研究確定LAPTM5是質(zhì)膜上T細(xì)胞和B細(xì)胞受體水平的負(fù)調(diào)節(jié)劑。而在巨噬細(xì)胞中，其作用與在T細(xì)胞和B細(xì)胞活化中的負(fù)向調(diào)節(jié)作用剛好相反，LAPTM5充當(dāng)巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)劑，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[18]。

FCER1G基因主要編碼IgE受體Ig的Fc片段，該蛋白是一種銜接蛋白，其包含基于免疫受體酪氨酸的激活基序，可轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)自各種免疫受體的激活信號(hào)。與FCER1G基因相關(guān)的疾病包括出血性疾病、血小板型出血性紫癜和哮喘[19]。CTSS基因可編碼組織蛋白酶S，該蛋白質(zhì)是肽酶C1家族的成員，是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，可參與抗原蛋白降解為肽的過(guò)程，從而呈遞給MHCⅡ類(lèi)分子。組織蛋白酶S主要在巨噬細(xì)胞和(或)血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)發(fā)揮其細(xì)胞外酶和(或)自身蛋白質(zhì)的功能，它可以激活幾乎所有類(lèi)型的血管細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。因此，組織蛋白酶S對(duì)于巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)、分化和周轉(zhuǎn)等過(guò)程發(fā)揮著必不可少的作用[20]。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法揭示了可能參與ANCA相關(guān)性血管炎腎損害發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因。在ANCA相關(guān)性血管炎腎損害中，可能參與的關(guān)鍵基因有CD53、C1QC、TYROBP、CSF1R、CYBB、LAPTM5、FCER1G和CTSS，并且通過(guò)不同基因芯片數(shù)據(jù)對(duì)上述關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證。這些結(jié)果有助于闡明ANCA相關(guān)性血管炎腎損害發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，并為ANCA相關(guān)性血管炎腎損害的診斷提供了潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。