蔣金蓁，張白玉，楊銳，顏其貴

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

王成東等[1]從大熊貓糞便中分離出1 株A 組輪狀病毒(rotavirus，RV)，命名為大熊貓輪狀病毒(GPRV) CH-1 株。GPRV 主要感染幼齡大熊貓(5～11月齡)，引起幼齡大熊貓腹瀉甚至死亡。由于成年動(dòng)物感染RV 多為隱性經(jīng)過，并持久地向外界排毒，RV 對(duì)環(huán)境因子和許多常見消毒劑有較強(qiáng)抵抗力，導(dǎo)致某一地方發(fā)病，隨后每年會(huì)連續(xù)發(fā)生[2]，這對(duì)大熊貓的繁育、健康及野化放歸帶來重大威脅。

目前，針對(duì)GPRV 已建立常規(guī)PCR[3]及熒光定量PCR[4]檢測(cè)方法，具有特異、敏感、高通量等特點(diǎn)。曾楊茹等[5]使用上述2 種方法對(duì)2011、2012、2013、2015 年的共 227 份大熊貓糞便 GPRV 攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)，利用熒光定量 PCR 檢出陽(yáng)性率為11%，而常規(guī) PCR 檢出陽(yáng)性率僅為 6.6%。及早發(fā)現(xiàn)GPRV 感染，更早接受治療，可降低病毒傳播和死亡風(fēng)險(xiǎn)[6]。熒光定量PCR 對(duì)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)條件要求過高，不能廣泛推廣；因此，加強(qiáng)對(duì)GPRV 感染的監(jiān)測(cè)和開發(fā)簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度的實(shí)驗(yàn)室診斷方法是當(dāng)務(wù)之急。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是在等溫(60～65 ℃)條件下，由2 對(duì)特異性引物針對(duì)靶基因的6 個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別，在 DNA 聚合酶的作用下，短時(shí)間(通常少于1 h)內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，其結(jié)果可直接肉眼觀察[7-8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，在 LAMP 反應(yīng)中加入環(huán)引物，能明顯加快擴(kuò)增速度，提高檢測(cè)效率。本研究中，筆者根據(jù)GPRV CH-1 株VP4 基因設(shè)計(jì)引物，建立GPRV 可視化LAMP 方法，并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期利用 LAMP 方法快速、有效的診斷GPRV 的早期感染和隱性感染。

1 材料與方法

1.1 供試病毒株

供試的 GPRV CH-1 株、大熊貓犬瘟熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病毒(CPV)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物微生物與免疫研究室分離和保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank 中GPRV VP4 基因保守區(qū)域序列(登錄號(hào)為 HQ641296)，使用 Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì) 3對(duì)LAMP 引物。具體引物信息列于表1。選取VP4基因上的2 段高度保守序列設(shè)計(jì)常規(guī)PCR 引物。上游引物為5'-TGGCTTCGCTCATTTATAGACA-3'，下游引物為 5'-TTGTGTCTGTGACGTATTCT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為409 bp。引物由成都擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 LAMP 擴(kuò)增引物序列Table 1 The primers for LAMP

1.3 病毒基因組RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄

按照MAGEN 病毒RNA 提取試劑盒操作說明書，提取GPRV 的總RNA，置于-80 ℃保存。按照寶生物(Takara)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA。

1.4 LAMP 方法的建立

采用25 μL 體系擴(kuò)增，其組分和終濃度分別為1×Isothermal Amplification Buffer( 紐 英 倫 ) 、1×LAMP 可見光染料(天恩澤)、0.2 μmol/L F3 和 B3，1.6 μmol/L FIP和BIP、0.4 μmol/L Loop F和Loop B、8.0 mmol/L MgSO4(紐英倫)、1.6 mmol/L dNTPs(紐英倫)、8 U Bst DNA 聚合酶(紐英倫)、0.4 mol/L 甜菜堿、1 μL cDNA 模板，加 ddH2O 至 25 μL。以MA104 細(xì)胞RNA 為陰性對(duì)照和ddH2O 為空白對(duì)照同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)溫度為65 ℃，反應(yīng)時(shí)間為40 min。反應(yīng)結(jié)束后，80 ℃加熱2 min 終止反應(yīng)。同時(shí)，用2%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 LAMP 反應(yīng)條件的優(yōu)化

在其他條件不變的情況下，分別調(diào)整LAMP 反應(yīng)體系中Mg2+終濃度為2、4、6、8、10 mmol/L，或甜菜堿終濃度為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L，或Bst DNA 聚合酶終濃度為4、8、12、16 U，或反應(yīng)溫度為 60、61、62、63、64、65 ℃進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，各取5 μL 進(jìn)行電泳鑒定，依據(jù)條帶的清晰度確定Mg2+、甜菜堿和Bst DNA 聚合酶的最佳反應(yīng)濃度及最佳反應(yīng)溫度。

1.6 特異性和重復(fù)性檢測(cè)

分別以GPRV、CDV、CPV 為模板，采用建立并優(yōu)化的LAMP 方法進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)其對(duì)GPRV 的特異性。選擇高(50 ng/μL)、中(5 ng/μL)、低(0.5 ng/μL)3 個(gè)不同濃度的病毒RNA 為模板，進(jìn)行批內(nèi)及批間試驗(yàn)，評(píng)估該方法檢測(cè)GPRV 試驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。每個(gè)樣品重復(fù)10 次。

1.7 靈敏性檢測(cè)

為確定LAMP 的最低檢測(cè)限度，先用分光光度計(jì)測(cè)定GPRV 的RNA 濃度；再通過10 倍倍比稀釋，將 RNA 稀釋成 50、5、5×10-1、5×10-2、5×10-3、5×10-4、5×10-5、5×10-6、5×10-7ng/μL 共 9 個(gè)梯度濃度；按優(yōu)化的LAMP 體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；擴(kuò)增結(jié)束后，分別進(jìn)行可見光染料顏色變化觀察及 2%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物。

用分光光度計(jì)測(cè)定GPRV 的cDNA 濃度，再通過10 倍倍比稀釋，將cDNA 稀釋10 個(gè)梯度濃度。按優(yōu)化的 LAMP 體系，對(duì) 10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的 5 個(gè)梯度濃度的 GPRV cDNA 進(jìn)行 LAMP擴(kuò)增。同時(shí)，利用常規(guī)PCR 引物，對(duì)10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的 5 個(gè)梯度濃度的 GPRV cDNA進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測(cè)。常規(guī)PCR 檢測(cè)采用25 μL 體系進(jìn)行擴(kuò)增，其組分和用量為 1×T3 PCR Mix 22 μL(擎科)、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、cDNA模板1 μL。常規(guī)PCR 檢測(cè)擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃循環(huán)變性 10 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸15 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃末延伸2 min；4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，各取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.8 臨床樣品檢測(cè)

利用優(yōu)化好的LAMP 方法及常規(guī)PCR 方法，對(duì)50 份大熊貓腹瀉糞便樣本進(jìn)行GPRV 病原檢測(cè)，以GPRV CH-1 株作為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O 作為陰性對(duì)照。采用熒光定量PCR 方法[6]驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 采用LAMP 方法檢測(cè)GPRV 的結(jié)果

圖1-a 所示，以GPRV CH-1 株cDNA 為模板的擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)大小不同的梯狀條帶，而陰性對(duì)照(MA104 細(xì)胞)和空白對(duì)照(ddH2O)沒有任何條帶。圖1-b 所示，以GPRV CH-1 株cDNA 為模板的陽(yáng)性擴(kuò)增樣品的顏色從紫色變?yōu)樗{(lán)色，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照未見顏色變化。

圖1 LAMP 方法檢測(cè)GPRV 的結(jié)果Fig.1 The results of GPRV detected by LAMP

2.2 LAMP 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

圖2 所示，當(dāng)Mg2+濃度為2、4 mmol/L 時(shí)，無法實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增；當(dāng)Mg2+濃度為6 mmol/L時(shí)，梯狀條帶不清晰，擴(kuò)增效率較低；當(dāng)Mg2+濃度為8、10 mmol/L 時(shí)，條帶清晰，擴(kuò)增效果達(dá)到最佳。可見，最適Mg2+濃度為8.0 mmol/L。

圖2 LAMP 方法的反應(yīng)體系中不同Mg2+濃度的電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis results of different concentrations of Mg2+ in the LAMP reaction system

圖3 所示，不添加甜菜堿時(shí)也能出現(xiàn)較明顯的擴(kuò)增條帶。當(dāng)甜菜堿濃度為0.2、0.4 mol/L 時(shí)，其梯狀條帶比不添加甜菜堿更弱，其擴(kuò)增效率更低，這可能是低濃度甜菜堿對(duì) LAMP 反應(yīng)有一定的抑制作用；隨后，隨著甜菜堿濃度的增加，擴(kuò)增效率提高，條帶清楚明亮，在甜菜堿濃度為 0.6 mol/L時(shí)，比甜菜堿濃度為0.8 mol/L 和不添加時(shí)更清晰，但無法說明高濃度甜菜堿對(duì)LAMP 反應(yīng)有影響。可見，最適甜菜堿濃度為0.6 mol/L。

圖3 LAMP 方法的反應(yīng)體系中不同甜菜堿濃度的電泳結(jié)果Fig.3 The electrophoresis results of different concentrations of betaine in the LAMP reaction system

圖4 所示，Bst DNA 聚合酶對(duì)LAMP 擴(kuò)增的影響不大，低濃度酶擴(kuò)增的條帶與高濃度酶擴(kuò)增的條帶相差不大，但為了保證擴(kuò)增效率，選擇終濃度12 U 為最適Bst DNA 聚合酶濃度。

圖4 LAMP 方法的反應(yīng)體系中不同Bst DN A 聚合酶濃度的電泳結(jié)果Fig.4 The electrophoresis results of different concentrations of Bst polymerse in the LAMP reaction system

圖5 所示，在60～65 ℃時(shí)，均能發(fā)生擴(kuò)增，62℃時(shí)，擴(kuò)增出的梯狀條帶較其他溫度的擴(kuò)增條帶更清晰明亮。選擇62 ℃為最適反應(yīng)溫度。

圖5 LAMP 方法的不同反應(yīng)溫度的電泳結(jié)果Fig.5 The electrophoresis results of different temperature in the LAMP reaction system

經(jīng)過對(duì)LAMP 反應(yīng)體系的條件優(yōu)化，其最佳反應(yīng)條件為：25 μL 體系的組分和終濃度分別為1×Isothermal Amplification Buffer、1×LAMP 可見光染料、0.2 μmol/L F3 和 B3、1.6 μmol/L FIP 和 BIP、0.4 μmol/L Loop F 和 Loop B、1.6 mmol/L dNTPs、8.0 mmol/L MgSO4、0.6 mol/L 甜菜堿、12 U Bst DNA 聚合酶、1 μL cDNA 模板，加 ddH2O 至 25 μL；反應(yīng)溫度為62 ℃；反應(yīng)時(shí)間為40 min；反應(yīng)結(jié)束后80 ℃加熱2 min 終止反應(yīng)。

2.3 供試方法的特異性和重復(fù)性

由圖6 可知，只有在GPRV cDNA 為模板時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)有梯狀條帶的陽(yáng)性擴(kuò)增?？梢?，所建立的LAMP 方法特異性良好。重復(fù)性試驗(yàn)顯示，批內(nèi)及批間的變異系數(shù)均小于 1%，說明該方法的重復(fù)性好，可進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)。

圖6 LAMP 方法的特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.6 The result of specific detection of LAMP

2.4 供試方法的靈敏性

從圖7 可知，LAMP 方法能檢測(cè)到的最低RNA濃度為5×10-5ng/μL，管中顏色變化明顯，與凝膠電泳結(jié)果一致(圖 8)。圖 9 所示，LAMP 方法能擴(kuò)增稀釋到10-9梯度濃度的cDNA，而常規(guī)PCR 方法僅能擴(kuò)增稀釋到10-7梯度濃度的cDNA。該結(jié)果表明，LAMP 方法的靈敏性較常規(guī)PCR 方法高約100 倍。

圖7 LAMP 方法的最低檢測(cè)限測(cè)定可視化結(jié)果Fig.7 The visual results of the minimum detection of LAMP

圖8 LAMP 方法的最低檢測(cè)限測(cè)定電泳結(jié)果Fig.8 The el ectrophoresis results o f t he minimum d etection o f LAMP

圖9 LAMP 方法和常規(guī)PCR 方法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.9 The result of sensitivity of LAMP and PCR

2.5 LAMP 方法的應(yīng)用

對(duì) 50 份大熊貓糞便樣本進(jìn)行 RV 檢測(cè)，常規(guī)PCR 檢測(cè)到陽(yáng)性樣本17 份，陽(yáng)性率為34%；LAMP檢測(cè)到陽(yáng)性樣本22 份，陽(yáng)性率為44%；LAMP 方法比常規(guī)PCR 方法多檢出5 份陽(yáng)性樣本。熒光定量PCR 方法檢測(cè)到陽(yáng)性樣本22 份，LAMP 方法的檢測(cè)結(jié)果與其吻合度為100%。

3 結(jié)論與討論

本研究中，在優(yōu)化LAMP 方法檢測(cè)GPRV RNA的4 個(gè)反應(yīng)因素中，Mg2+濃度對(duì)該方法的影響最大。當(dāng)Mg2+濃度小于6 mmol/L 時(shí)，靶基因無法擴(kuò)增。這主要是由于 Mg2+在反應(yīng)中的作用是形成dNTP-Mg 絡(luò)合物與核酸骨架相互作用，穩(wěn)定堿基形成中的中間體，影響B(tài)st 聚合體[10-11]。甜菜堿在LAMP 反應(yīng)中不是絕對(duì)必要的，不添加甜菜堿的擴(kuò)增帶比添加低濃度甜菜堿的擴(kuò)增帶更清晰，但隨著甜菜堿濃度的增加，當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mol/L 時(shí)得到了合適的擴(kuò)增。然而，由于甜菜堿對(duì)酶的活性有穩(wěn)定作用，這也增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性[12]，所以在LAMP 反應(yīng)體系中加入0.6 mol/L 甜菜堿。Bst DNA聚合酶的濃度對(duì)反應(yīng)影響不大，低濃度的酶也能擴(kuò)增出清晰的條帶，與高濃度時(shí)的條帶無明顯差異。為保證加樣的準(zhǔn)確性和擴(kuò)增效率，在LAMP 反應(yīng)體系中加入12 U Bst DNA 聚合酶。與常規(guī)PCR 不同，溫度對(duì)LAMP 的影響不是對(duì)核酸的影響，而是對(duì)Bst聚合酶的影響[13]。在60～65 ℃時(shí)均可產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，適用于溫度控制較差的地區(qū)。

本研究建立的 LAMP 反應(yīng)對(duì)大熊貓感染的犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒等無交叉反應(yīng)，只能擴(kuò)增出RV?？梢?，LAMP 方法對(duì)RV 基因組有高度特異性。LAMP 反應(yīng)靈敏度高，RV RNA 的檢測(cè)限為5×10-5ng/μL，其靈敏度是常規(guī) PCR 的 100 倍。雖然 LAMP的高靈敏度使其易受氣溶膠誘導(dǎo)的假陽(yáng)性，但為了避免二次開蓋污染的風(fēng)險(xiǎn)，選擇 LAMP 可見光染料，可直接添加到反應(yīng)體系中，顏色的變化可直接用肉眼觀察。對(duì)50 份大熊貓糞便樣本的RV 攜帶情況檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)PCR 和LAMP 均檢測(cè)到的陽(yáng)性樣本17 份，另有5 份樣本僅使用LAMP 檢測(cè)到陽(yáng)性；使用熒光定量 PCR 對(duì)樣本進(jìn)行驗(yàn)證，LAMP方法與其陽(yáng)性吻合度為 100%?？梢?，LAMP 方法比常規(guī)PCR 方法更適合GPRV 的初步診斷和監(jiān)測(cè)。

LAMP 方法加熱過程簡(jiǎn)單，不需要熱循環(huán)器，使用傳統(tǒng)的水浴鍋即可完成擴(kuò)增；可直接觀察反應(yīng)結(jié)果，不需要電泳，不需要紫外線，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，且用于檢測(cè)的儀器和試劑價(jià)格低廉。雖然熒光定量PCR 技術(shù)的敏感性高于LAMP 技術(shù)，但由于熒光定量PCR 技術(shù)的設(shè)備和試劑成本較高，在大規(guī)模疾病暴發(fā)中難以推廣。在野生大熊貓輪狀病毒監(jiān)測(cè)中，LAMP 技術(shù)由于其設(shè)備要求低、靈敏度高，可更快速、方便地投入使用。

綜上所述，本研究開發(fā)的檢測(cè)GPRV 的LAMP方法較常規(guī)PCR 方法靈敏度更高，檢測(cè)時(shí)間更短；較熒光定量PCR 方法成本低廉，設(shè)備簡(jiǎn)單，可通過肉眼直接觀察結(jié)果?；诖耍琇AMP 方法可作為快速檢測(cè)大熊貓輪狀病毒的有效工具，甚至可用于野生大熊貓輪狀病毒的監(jiān)測(cè)。