樊鵬飛，康心，程健琳，李菲菲，劉璨，胡聰聰，楊治凡，楊勝園

(1.南華大學 公共衛(wèi)生學院，湖南 衡陽 421001；2.衡陽市健康危害因子檢驗檢疫新技術研究重點實驗室，湖南 衡陽 421001)

人造酶是一種非結(jié)構(gòu)蛋白的合成催化劑，具有與天然酶類似的催化活性[1]。自2007年Yan等[2]發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米顆粒具有過氧化物模擬酶活性以來，多種納米材料[3-7]被發(fā)現(xiàn)具有模擬酶活性。在這些納米材料中，含鐵材料由于具有優(yōu)異的催化性能、低毒性、溫和的反應條件而被稱為綠色催化劑或載體[8-9]。Fe2O3是各鐵氧化物中最穩(wěn)定的材料[10]，且來源豐富，價格低，抗腐蝕性強以及電、磁和催化性能優(yōu)良[11]。本文通過水熱法合成一種新型鐵基納米管-Fe2O3納米管，研究其模擬酶活性，并應用于H2O2的檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

FeCl3、NaH2PO4、Na2SO4、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、辣根過氧化物酶(HRP)、無水乙酸鈉、冰醋酸、無水乙醇、H2O2均為分析純；實驗用水為超純水(18.25 MΩ·cm)。

UV2550型紫外-可見分光光度計；PB-20(PB-S)型精密酸度計；FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN場發(fā)透射電子顯微鏡；X射線光電子能譜儀。

1.2 Fe2O3納米管的合成

將259.52 mg FeCl3、40 mL超純水、2.00 mg NaH2PO4和12.49 mg Na2SO4加入100 mL平底燒瓶中，在室溫下攪拌10 min。將混合物轉(zhuǎn)移至 50 mL 聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓釜中，220 ℃水熱處理48 h，自然冷卻至室溫。離心，用去離子水和無水乙醇依次清洗，在80 ℃真空干燥12 h，得到紅色粉末。

1.3 H2O2檢測

TMB和HRP標準溶液的濃度分別為5.0 mmol/L 和2.0 mg/mL。在2.0 mL Ep管中，依次加入TMB(3.0 mmol)、HAc-NaAc緩沖液(pH 3.5)和不同量的H2O2溶液，混合后加入Fe2O3納米管(4.0 mg/mL，10 μL)溶液，用超純水稀釋至 400 μL，在60 ℃下反應 25 min，同時做試劑空白。用紫外-可見分光光度計掃描，得到紫外可見吸收光譜。在最大吸收波長652 nm處測定體系吸光度(A)和試劑空白(A0)，ΔA=A-A0。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe2O3納米管的表征

Fe2O3納米管的表觀形貌見圖1。

圖1 Fe2O3的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscope image ofFe2O3 nanotubes

由圖1可知，所合成的納米材料呈均勻管狀，平均直徑約140 nm，平均長度約180 nm。

用X射線光電子能譜(XPS)確認Fe2O3納米管的結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖2。

圖2 Fe2O3的XPS圖(a)、Fe 2p(b)、O 1s(c)的高分辨率光譜圖Fig.2 XPS survey scan(a) and corresponding highresolution spectra of Fe 2p(b) and O 1s(c)

由圖2可知，結(jié)合能530 eV和710 eV的光電子線分別歸因于O 1s和Fe 2p。Fe 2p中位于 710.64 eV 的光電子峰(圖2b)歸因于Fe2O3的 Fe 2p3/2。O 1s光譜(圖2c)在529.78 eV達到峰值，這歸因于Fe—O的結(jié)合能。

通過TEM和XPS，確定了Fe2O3納米管的成功合成[12]。

2.2 Fe2O3納米管的過氧化物模擬酶活性研究

在H2O2的存在下測試了Fe2O3納米管對過氧化物酶底物TMB的催化作用，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，該體系在652 nm處有特征吸收，表明Fe2O3納米管在H2O2存在下可以將TMB轉(zhuǎn)化為oxTMB[13]。不同體系的顯色反應不一樣，管1為只有H2O2和TMB存在時溶液顯色情況；管3為溶液中含有Fe2O3納米管和TMB時的顏色，溶液呈現(xiàn)Fe2O3納米管的顏色；只有在Fe2O3納米管、H2O2和TMB共同存在的條件下，F(xiàn)e2O3納米管可以發(fā)生模擬過氧化物酶的催化反應，使溶液呈現(xiàn)藍綠色(管2)。

圖3 紫外可見吸收光譜圖Fig.3 UV visible absorption spectra of the systema.TMB+H2O2；b.TMB+H2O2+Fe2O3納米管

2.3 Fe2O3納米管與其浸出液催化性能的比較

為了探究Fe2O3納米管的過氧化物酶活性是由其自身而不是由浸出溶液中的金屬離子引起，將Fe2O3納米管浸入pH為3.5的HAc-NaAc緩沖溶液中2 h后離心分離，取上清液驗證其過氧化物酶活性。結(jié)果表明，F(xiàn)e2O3納米管浸出溶液在H2O2存在下不能催化TMB氧化生成oxTMB。

2.4 穩(wěn)態(tài)動力學研究

通過Fe2O3納米管過氧化物模擬酶對于反應底物H2O2和TMB穩(wěn)態(tài)動力學實驗，研究Fe2O3納米管過氧化物模擬酶催化活性，結(jié)果見圖4。

圖4 穩(wěn)態(tài)動力學測定及催化機理Fig.4 Steady-state kinetics assay and catalytic mechanism

由圖4可知，F(xiàn)e2O3納米管催化H2O2氧化TMB的過程符合典型Michaelis-Menten方程。由圖4a、4b可知，隨底物H2O2和TMB濃度的增加，催化反應初速度逐漸增大，結(jié)果與HRP催化反應動力學一致(圖4c、4d)，進一步證明了Fe2O3納米管具有酶的催化性能。

為了進一步研究Fe2O3納米管模擬過氧化物酶的催化機理，通過改變H2O2和TMB的濃度，確定了Fe2O3納米管-底物濃度的初始反應速度的雙倒數(shù)曲線(圖4e、4f)。從平行的雙倒數(shù)曲線可以看出，以Fe2O3納米管為基礎的過氧化物酶催化機理與乒乓機理一致，即Fe2O3納米管先與第一個底物結(jié)合，并發(fā)生反應，與第二個底物反應之前釋放出第一個底物。

米氏常數(shù)(Km)是酶的特性常數(shù)，Km值越大，表明酶與底物的親和力越小。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)關系曲線得到Fe2O3納米管與HRP的Km和最大反應速率(Vmax)，結(jié)果見表1。

由表1可知，F(xiàn)e2O3納米管對于底物H2O2的米氏常數(shù)小于HRP，表明Fe2O3納米管對H2O2的親和力高于HRP對H2O2的親和力，這主要是由于Fe2O3納米管的比表面積較大，且其表面對H2O2的靜電相互作用，從而使得親和力增強。而Fe2O3納米管對于底物TMB的米氏常數(shù)大于HRP，表明Fe2O3納米管對TMB的親和力較HRP弱，但是Fe2O3納米管對TMB的最大反應速率卻明顯優(yōu)于HRP，說明Fe2O3納米管的過氧化物模擬酶活性較HRP強。

2.5 Fe2O3納米管和HRP的穩(wěn)定性比較

為了考察Fe2O3納米管在不同pH和溫度下的穩(wěn)定性，分別在pH 1～12和0～90 ℃下處理Fe2O3納米管和HRP 2 h，根據(jù)其相對活性判斷穩(wěn)定性，結(jié)果見圖5。

圖5 Fe2O3納米管和HRP的穩(wěn)定性比較Fig.5 Comparison of stability of Fe2O3 nanotubes and HRP

由圖5可知，F(xiàn)e2O3納米管在酸性條件下的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于HRP，且Fe2O3納米管的溫度穩(wěn)定性優(yōu)于HRP，在高溫條件下仍能保持較高的活性。

2.6 Fe2O3納米管可視化檢測H2O2

2.6.1 H2O2檢測條件的優(yōu)化 H2O2和TMB作為酶促反應的底物，其濃度對Fe2O3納米管的過氧化物酶催化活性有較大影響，同時，溶液酸堿度、溫度也會對酶活性有影響。故本文對溶液pH、溫度、反應時間、H2O2和TMB的濃度等實驗參數(shù)進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當Fe2O3在pH 3.5 NaAc-HAc緩沖液中，與0.2×10-3mol/L H2O2和3.0×10-3mol/L TMB在60 ℃條件下反應25 min時，相對活性達到最高。

2.6.2 線性范圍、檢出限及精密度 在優(yōu)化的實驗條件下，按照1.3節(jié)的實驗方法分別測定不同濃度的H2O2溶液，結(jié)果表明，H2O2在1.07×10-6～1.00×10-4mol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關系，線性回歸方程為A=0.019 9+11.321c(×10-3mol/L)，相關系數(shù)r=0.997 7。經(jīng)11次空白平行測定，按照LOD=3Sb/k，計算出H2O2的檢出限為3.22×10-7mol/L，相對標準偏差為0.12%，說明本方法具有較好的精密度。

2.7 樣品分析及回收率測定

采集了新鮮的雨水和某品牌礦泉水，采用標準加入法向樣品中加入H2O2標準溶液，測定加標樣中的H2O2含量，計算加標回收率，結(jié)果見表2。

表2 水樣中H2O2的檢測結(jié)果(n=7)Table 2 Determination results of H2O2 in water samples

3 結(jié)論

合成的Fe2O3納米管具有與辣根過氧化物酶相似的過氧化物酶活性。Fe2O3納米管的催化活性依賴于溶液的pH、反應溫度和H2O2的濃度。與HRP相比，F(xiàn)e2O3納米管對H2O2的親和力更高，且有更強的化學穩(wěn)定性。因此，建立了一種簡單、廉價、靈敏的比色法測定H2O2方法。