劉佳茜，侯麗君，劉婷婷，王沛媛，高祥，林雁冰*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

塑料產(chǎn)品由于成本低廉、不易腐爛和適用范圍廣泛等，在人類(lèi)生活中被大量使用，但同時(shí)，自然環(huán)境中的塑料污染問(wèn)題也愈發(fā)嚴(yán)重。特別在農(nóng)業(yè)中，塑料地膜的使用在提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的同時(shí)也使農(nóng)田中白色污染問(wèn)題愈加嚴(yán)重[1-4]?，F(xiàn)階段，農(nóng)用地膜大部分為聚乙烯材料，其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并難以降解[5-6]，殘留在農(nóng)田中的地膜會(huì)影響土壤結(jié)構(gòu)與功能，甚至影響植物生長(zhǎng)[7-8]。目前對(duì)廢棄塑料地膜的處置方式大多為填埋、焚燒、二次加工等，這些處理方式對(duì)環(huán)境的污染較大，且處理成本高[9]。因此，地膜殘留問(wèn)題現(xiàn)已成為全球環(huán)境污染的熱點(diǎn)問(wèn)題。

近年來(lái)，生物降解地膜的出現(xiàn)在一定程度上減輕了農(nóng)田中聚乙烯地膜的污染問(wèn)題。聚己二酸/對(duì)苯二甲酸丁二酯（Polyadipate/butylene terephthalate，PBAT）是一種可生物降解的聚合物，其具有良好的耐熱性和延伸性，在土壤微生物作用下可降解為無(wú)毒小分子，對(duì)生態(tài)環(huán)境友好。目前全球PBAT 產(chǎn)量占生物塑料總產(chǎn)量的7.2%，PBAT 地膜已成為生物降解地膜中常見(jiàn)的一種，已經(jīng)逐漸商業(yè)化[10-12]。2011年，國(guó)家發(fā)改委出臺(tái)的《產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄（2011年本）》中指出，要鼓勵(lì)使用生物降解材料，推動(dòng)農(nóng)用薄膜無(wú)污染降解技術(shù)的開(kāi)發(fā)和利用。2017 年，全生物降解材料被列入《“十三五”材料領(lǐng)域科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)規(guī)劃》。自此，PBAT地膜的年生產(chǎn)量從2011年的1.19萬(wàn)t增長(zhǎng)至2018年的3.38萬(wàn)t。據(jù)綜合農(nóng)膜發(fā)展趨勢(shì)以及塑料污染防控政策預(yù)測(cè)分析，PBAT地膜的產(chǎn)量將增至每年34萬(wàn)t[13]。

雖然PBAT 屬于可降解材料，但有研究表明其在特定條件下才能達(dá)到較好的降解效果，實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中其降解情況并不理想，鄔強(qiáng)等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在棉花種植過(guò)程中鋪施PBAT地膜，180 d后，PBAT地膜表面僅出現(xiàn)細(xì)小裂紋，降解程度不明顯。目前關(guān)于PBAT地膜的降解菌種資源還較少，且現(xiàn)有菌種在溫和條件下對(duì)PBAT 的降解效果不理想[15-16]。因此，深入尋找對(duì)PBAT塑料地膜的高效降解菌株非常必要。

本試驗(yàn)從垃圾場(chǎng)下層土壤中篩選對(duì)PBAT 有潛在降解作用的菌種，通過(guò)降解性能測(cè)定，擬篩選可以高效降解PBAT 地膜的菌株，旨在豐富PBAT 降解菌種資源庫(kù)，為PBAT 地膜降解提供理論支持和參考，有利于生物降解地膜的推廣。

1 材料與方法

1.1 塑料樣品與塑料降解菌來(lái)源

本試驗(yàn)使用的塑料地膜樣品類(lèi)型為PBAT 生物可降解地膜，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)徐靜教授提供。本試驗(yàn)菌株分離自長(zhǎng)期存在PBAT 塑料地膜污染的陜西省楊凌示范區(qū)曹新莊生活垃圾填埋場(chǎng)的下層土壤。

1.2 試驗(yàn)儀器與培養(yǎng)基

所需儀器有高壓蒸汽滅菌鍋（GI54TW），超聲波清洗器（KQ-250B），恒溫培養(yǎng)搖床（ZWY-2102C），恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9272），PCR 儀（SimpliAmp），酶標(biāo)儀（Epoch），電泳儀（Powerpac Basic），凝膠成像儀（Biorad Gel Imager），掃描電子顯微鏡（S-4800；Hitachi，Japan），原子力顯微鏡（Multimode-8；Bruker，USA），傅里葉變換紅外光譜儀（Vetex70；Bruker，Germany）和水接觸角儀（JC2000D1；Powereach，China）等。

所需培養(yǎng)基有微量碳源培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基、LB 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、脲酶產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基、碳源利用試驗(yàn)培養(yǎng)基、脂肪酶產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基、H2S 產(chǎn)生培養(yǎng)基、淀粉降解試驗(yàn)培養(yǎng)基、漆酶產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基以及過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基等[17-19]。

1.3 PBAT地膜降解菌的篩選

膜片表面滅菌處理：將PBAT 地膜剪成大小為2 cm×1.5 cm 的膜片，然后依次浸泡于2% SDS、75%乙醇、95%乙醇中4 h，再用無(wú)菌水沖洗干凈，置于紫外滅菌燈下滅菌15 min[20]。

將1.0 g 土壤加入9.0 mL 微量碳源液體培養(yǎng)基中，并加入 1 片預(yù)處理過(guò)的 PBAT 膜片，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d；再將膜片轉(zhuǎn)接入10.0 mL 新的微量碳源液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10 d。使用PBS 溶液（0.1 mol·L-1）振蕩清洗膜片，將菌懸液轉(zhuǎn)接入30 mL含有0.1 g 左右PBAT 地膜的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，180 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)30 d。使用稀釋平板涂布法，吸取培養(yǎng)30 d 后的培養(yǎng)懸液涂布于LB 固體培養(yǎng)基，挑選優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行多次分離純化，得到對(duì)PBAT有潛在降解能力的菌株。

1.4 PBAT地膜降解菌的鑒定

使用堿裂解法提取細(xì)菌總DNA[21]，以其為模板，以27F/1492R（27F：5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）和P1/P6（P1：5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCT?CAGAACGAACG CT-3′；P6：5′-CGGGATCCTACG?GCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，并選取同源性相近的菌株，采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，構(gòu)建方法為Neighbor-joining，檢驗(yàn)方法為Bootstrp method，比對(duì)次數(shù)為1 000。

1.5 PBAT地膜降解率的測(cè)定

將分離、純化得到的潛在PBAT 降解菌株于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液，沉淀菌體用0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液沖洗。將菌體接種于含有30 mL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中，調(diào)整并保持菌液的OD600值為0.8～1.0。加入0.1 g 表面滅菌的PBAT 塑料地膜膜片（滅菌方法同1.3），28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)8周。將不接種菌懸液的含有PBAT 膜片的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)，作為空白對(duì)照（CK）。8 周后，將膜片表面沖洗干凈并干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算膜片失重率[2，22]。

膜片的失重率=（膜片初始質(zhì)量-膜片被降解后質(zhì)量）/膜片初始質(zhì)量×100%

1.6 掃描電子顯微鏡（SEM）以及原子力顯微鏡（AFM）觀察

將被降解8 周的膜片清洗干凈后自然干燥。固定噴金后在掃描電子顯微鏡（S-4800；Hitachi，Japan）下觀察其表面是否出現(xiàn)褶皺及孔洞等破損情況[2]。利用原子力顯微鏡（Multimode-8；Bruker，USA）掃描塑料地膜的表面特征，通過(guò)NanoScope Analysis 軟件分析圖像，觀察膜片表面的粗糙程度，掃描尺寸為5 mm×5 mm[2，23]。

1.7 傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）測(cè)定

將被降解8 周的膜片清洗干凈后自然干燥。使用傅里葉紅外光譜儀（Vetex70；Bruker，Germany）測(cè)定膜片表面的官能團(tuán)，掃描波長(zhǎng)范圍為600～4 000 cm-1，觀察降解后膜片表面是否有新的極性官能團(tuán)[5，24]。

1.8 水接觸角（WCA）測(cè)定

將降解8 周的塑料地膜清洗干凈后自然干燥，使用水接觸角計(jì)（JC2000D1；Powereach，China）進(jìn)行膜片靜水接觸角的測(cè)定，進(jìn)而分析膜片表面疏水性的變化[24-25]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

本研究數(shù)據(jù)運(yùn)用IBM SPSS Statistics 23 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析T檢驗(yàn)對(duì)不同處理進(jìn)行分析（n=3），利用OriginPro 2016繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PBAT地膜降解菌株鑒定結(jié)果

從以PBAT 地膜為唯一碳源的培養(yǎng)基中共篩選出56 株細(xì)菌。通過(guò)潛在降解菌生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)程度，挑選出6株優(yōu)勢(shì)菌作為潛在的高效PBAT塑料降解菌進(jìn)行后續(xù)降解性能分析。該6 株優(yōu)勢(shì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖 1 所示，菌株 N1-2、RD1-3 以及 D4-2 均屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），菌株D2-1、N3-2和D5-3分別屬于黃桿菌屬（Chryseobacterium）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）。

6 株潛在降解菌株的各項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果如表1 所示。菌株RD1-3 可以分泌的酶的種類(lèi)最多且可產(chǎn)生H2S。其他5 株潛在高效塑料降解菌均能分泌脂肪酶和淀粉酶，菌株N3-2 分泌脲酶的能力較高。

2.2 潛在降解菌對(duì)PBAT的降解能力

2.2.1 PBAT地膜失重率

由圖2可知，以PBAT 為唯一碳源時(shí)，菌株RD1-3對(duì)PBAT 膜片的降解率最高，8 周降解率可達(dá)6.88%±0.06%。其次為菌株N1-2 以及N3-2，對(duì)膜片的降解率分別可達(dá)6.49%±0.01%和6.54%±0.09%。其余菌株對(duì)PBAT 的降解率均在5%左右。由此可以初步推測(cè)，菌株RD1-3、N1-2以及N3-2對(duì)PBAT具有較高的降解作用。

2.2.2 PBAT地膜表面形態(tài)特征變化

掃描電鏡結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的原膜（ORI）以及CK 處理表面光滑平整，6 株潛在的PBAT 降解菌均可使膜片表面產(chǎn)生破損。菌株N1-2、RD1-3 以及D4-2處理組中，膜片表面均出現(xiàn)明顯的褶皺以及溝壑。在菌株N3-2、D2-1 以及D5-3 處理組中，膜片表面也出現(xiàn)細(xì)小溝壑以及微孔，但均不明顯（圖3）。

表1 潛在降解菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of potentially degrading bacteria

圖4 為原子力顯微鏡下觀察到的降解8 周后PBAT地膜表面特征。ORI和CK組中膜片表面粗糙程度很輕，較為平整。在菌株N1-2、RD1-3 以及D5-3降解8 周后，PBAT 膜片表面出現(xiàn)明顯凸起及凹陷，粗糙程度加深。其余處理組的膜片表面粗糙度與CK組差別均不明顯。本結(jié)果與掃描電鏡結(jié)果相似，可以看出，菌株N1-2 以及RD1-3 對(duì)PBAT 膜片表面形態(tài)影響較大。

2.2.3 PBAT地膜的紅外光譜特征分析

PBAT為芳香族和脂肪族的聚合物。由圖5可知，紅外光譜圖中1 450 cm-1附近的苯環(huán)特征峰（—C6H4—）、1 716 cm-1附近的羰基特征峰（—C＝O）以及2 966 cm-1附近的—CH2—不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰均為PBAT 的特征峰。降解8 周后，6 株潛在PBAT 降解菌均向PBAT 結(jié)構(gòu)中引入了新的極性官能團(tuán)，如碳氮三鍵（2 350 cm-1附近）、碳碳雙鍵（3 099 cm-1附近）以及羥基（3 400～3 330 cm-1）等，極性官能團(tuán)的引入可以降低塑料膜片的穩(wěn)定性，從而使其更易被降解。菌株RD1-3 及N1-2 在2 350 cm-1附近的特征峰較其他菌株強(qiáng)，說(shuō)明該兩株菌能增強(qiáng)膜片的不穩(wěn)定性，從而更易對(duì)PBAT薄膜進(jìn)行降解。

2.2.4 PBAT地膜的疏水性特征分析

水接觸角能反映膜片表面疏水性大小，膜片表面疏水性降低是塑料被降解的重要表征[26]。如圖6 所示，降解8 周后，6 種菌株均可顯著降低PBAT 膜片表面水接觸角大小（P＜0.05），菌株D4-2以及N1-2降低膜片水接觸角的程度最大，分別降低至73.6°±1.3°和73.1°±1.4°。此外，菌株RD1-3 降低水接觸角的程度也較高（77.9°±0.7°）。由此可知，此3 株菌均能較大程度地降低膜片表面疏水性，從而證明3 株菌對(duì)PBAT塑料膜片具有較好的降解作用。

3 討論

塑料在降解過(guò)程中會(huì)發(fā)生很多物理、化學(xué)表征變化，最典型的降解特征為質(zhì)量發(fā)生損失，但質(zhì)量的降低程度不能完全反映塑料的降解程度[27]，因此本文除膜片降解率外，還對(duì)膜片表面微觀特征、表面疏水性、表面官能團(tuán)等進(jìn)行測(cè)定。綜合上述各指標(biāo)的結(jié)果，最終從6 株潛在PBAT 降解菌中選擇出RD1-3 和N1-2兩株菌，推測(cè)其為潛在高效PBAT 降解菌。大多數(shù)塑料降解菌都會(huì)通過(guò)分泌降解酶從而對(duì)塑料產(chǎn)生降解作用，如脲酶、漆酶、過(guò)氧化物酶以及脂肪酶等[28-29]。本試驗(yàn)中菌株RD1-3 具有合成并分泌多種胞外降解酶的能力。

菌株RD1-3 和N1-2 對(duì)PBAT 的降解率均在6%以上，與其他在常溫下進(jìn)行的研究相比降解率較高。如霍向東等[12]從南疆農(nóng)田中分離得到的鞘脂單胞菌XJSL2，其 60 d 的 PBAT 降解率僅不到 1%；Wang 等[27]研究發(fā)現(xiàn)PBAT地膜在常規(guī)農(nóng)田土壤中3個(gè)月的降解率僅為2.3%；Tan 等[30]在土壤中篩選出19 種細(xì)菌，其在30 ℃條件下對(duì)PBAT的絕對(duì)降解量均很低，且只有兩株菌對(duì)PBAT 造成可見(jiàn)的降解。另有研究表明，真菌對(duì)塑料地膜的降解率遠(yuǎn)高于細(xì)菌，如7 d內(nèi)，菊異莖點(diǎn)霉（Paraphoma ChrysanthemicolaB47-9）對(duì)該類(lèi)地膜的降解面積高達(dá)99.2%，但在現(xiàn)有研究中未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)PBAT有如此高的降解率[31]。提高降解體系的溫度或改變pH 值，以及在降解體系中加入氧助化劑等均能提高微生物對(duì)塑料膜片的降解率，如在溫度為58 ℃的堆肥條件下，PBAT 膜片48 d 的降解率可達(dá)64.3%[19，32-34]。但在自然環(huán)境中控制農(nóng)田溫度和酸度或添加助化劑實(shí)施較困難。本試驗(yàn)在常溫條件下進(jìn)行，目的是篩選出在常溫且溫和條件下即可以對(duì)PBAT 有高效降解作用的菌株。除降解率外，本研究中掃描電鏡、原子力顯微鏡、紅外光譜以及水接觸角結(jié)果，均能很好地展現(xiàn)菌株RD1-3 和N1-2 對(duì)PBAT良好的降解性。

菌株RD1-3 和N1-2 均屬于假單胞菌屬。關(guān)于假單胞菌屬細(xì)菌對(duì)塑料有降解作用的報(bào)道也較多。綠膿假單胞菌、惡臭假單胞菌和施氏假單胞菌等具有高效降解低密度聚乙烯的能力[35-38]。此外，該屬細(xì)菌對(duì)聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、氯代芳烴等也有降解作用[38-39]。假單胞菌對(duì)烴類(lèi)化合物產(chǎn)生降解能力的原因之一為其攜帶編碼烷烴羥化酶的基因，可以利用氧分子從而在塑料穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)中引入不穩(wěn)定的含氧官能團(tuán)[40]。

推測(cè)兩株高效降解菌RD1-3 和N1-2 可通過(guò)產(chǎn)生多種酶對(duì)烴鏈進(jìn)行降解。此外，PBAT 塑料膜片疏水性降低、粗糙度增加、產(chǎn)生破損以及新的極性官能團(tuán)的引入，均有利于微生物在膜表面的附著和薄膜的分解，從而進(jìn)一步加快了菌株的降解作用[26，41]。

4 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)從垃圾場(chǎng)土壤中分離得到6 種潛在的PBAT塑料降解菌，通過(guò)對(duì)6株菌對(duì)PBAT降解性能結(jié)果的綜合分析，最終得到兩株高效降解PBAT 的假單胞菌，分別為Pseudomonassp. RD1-3 和Pseudomonassp.N1-2。

（2）28 ℃條件下，經(jīng)8 周培養(yǎng)，兩株菌對(duì)PBAT 地膜的降解率分別為6.88%±0.06%和6.49%±0.01%。

（3）兩株菌作用8 周后，PBAT 地膜表面均出現(xiàn)明顯的褶皺與溝壑，粗糙程度增加，且薄膜表面結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)新的極性官能團(tuán)，薄膜表面親水性增加。