郭光，田芳，丁克強(qiáng)，楊鳳，徐進(jìn)，李曉華，劉翀

（1.南京工程學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，南京 211167；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站，北京 100125；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的芳環(huán)構(gòu)成的化合物，主要存在于大氣、水體、土壤中，是環(huán)境中普遍存在的一類持久性有機(jī)污染物[1]。PAHs 主要是由礦物燃料（如煤、石油、天然氣等）、木材、紙張等碳?xì)浠衔锊煌耆紵蜻€原條件下熱結(jié)形成的。由于多數(shù)PAHs 有強(qiáng)的致癌性、致突變性以及致畸性，對(duì)全球環(huán)境和人類健康造成了極大的威脅[2]。苯并[a]芘（BaP）是一種具有5 環(huán)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)致癌性PAHs，是需要優(yōu)先控制的持久性污染物[3]。

常見的降解多環(huán)芳烴的方法有物理方法、化學(xué)方法以及生物方法。物理、化學(xué)法成本高，易產(chǎn)生二次污染[4]。利用生物法去除PAHs 具有經(jīng)濟(jì)、安全、殘留少等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用[5]。由于低環(huán)PAHs 分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、水溶性高，降解低環(huán)PAHs 的微生物較多。而4環(huán)及4環(huán)以上的PAHs分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、電子云密度高、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性差，降解微生物較少。因此，獲得能夠降解PAHs 的微生物是修復(fù)成功的前提。目前很多能夠降解PAHs 的微生物已經(jīng)被分離出來，并用于土壤修復(fù)[6]。Zhu 等[7]分離了一株能在7 d 內(nèi)降解76% BaP 的菌株Brevibacillus brevis。但生物法降解PAHs過程受到PAHs的種類、微生物的降解能力和種類及環(huán)境條件等的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌群對(duì)土壤中總PAHs 的降解效果高于單一菌株，對(duì)高環(huán)PAHs 的效果更明顯[8]。但是，到目前為止，對(duì)能降解高環(huán)PAHs的微生物菌群研究較少。

微生物修復(fù)從技術(shù)原理方面可分為生物刺激和生物強(qiáng)化兩大類型[2]。生物刺激是通過添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等刺激土著微生物降解活性來修復(fù)污染的方法。生物強(qiáng)化是利用實(shí)驗(yàn)室分離的微生物或經(jīng)污染物富集的微生物修復(fù)污染。Villaverde 等[9]利用泥漿反應(yīng)器修復(fù)芘污染的土壤，添加A.xylosoxidans后，芘的降解率提高了57.5%。Lu 等[10]利用污染土壤富集的土著菌群修復(fù)PAHs 污染的土壤，35 d 后，土壤中16 PAHs的含量從95.23 mg·kg-1降低到23.41 mg·kg-1。

基于此，本試驗(yàn)富集了一個(gè)可以降解BaP 的菌群，并對(duì)降解條件及其性能進(jìn)行研究，為BaP 的生物降解提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

BaP（96%）、芘（97%）、萘（99%）、菲（97%）、熒蒽（98%）均購(gòu)于Sigma Aldrich 公司，其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

配制 5 g·L-1BaP 的丙酮溶液，并用 0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾除菌。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2SO（42.0 g·L-1）、NH4C（l0.3 g·L-1）、CaCl（20.1 g·L-1）、KH2PO（42.0 g·L-1）、KC（l0.5 g·L-1）、NaCl（1.0 g·L-1）、MgCl2·6H2O（0.6 g·L-1），定容至 1 000 mL，調(diào)節(jié) pH 為 7.0，并取 100 mL 分別裝到250 mL 錐形瓶?jī)?nèi)，封口，用121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

菌群的富集[11]：使用微量注射器加入一定體積的Bap 溶液，在超凈工作臺(tái)中揮發(fā)丙酮溶液。取5 g 石油污染土壤添加到100 mL 含有BaP（初始濃度為3 mg·L-1）的培養(yǎng)基，在 30 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)。每2 周取10 mL 上清液于新鮮培養(yǎng)基（芘濃度增加3 mg·L-1）作為下一代菌群培養(yǎng)，連續(xù)富集10次，至培養(yǎng)基的BaP濃度為30 mg·L-1，并以此為儲(chǔ)備菌液。

1.2 菌株對(duì)PAHs的降解試驗(yàn)

將儲(chǔ)備液按照10%的比例接種到含有BaP（初始濃度為 30 mg·L-1）和 80 mg·L-1酵母粉的 50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r·min-1下避光振蕩培養(yǎng)10 d獲得初始接種菌。無菌條件下，將初始菌懸液按照10%的比例接種到含有不同PAHs 和80 mg·L-1酵母粉的10 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，BaP、芘、熒蒽、菲的初始濃度分別為 30、60、60、100 mg·L-1。培養(yǎng)條件同上。定時(shí)取樣測(cè)定生物量和剩余PAHs 含量。同時(shí)設(shè)滅活菌作對(duì)照，每個(gè)處理各3個(gè)重復(fù)。

1.3 生物量的測(cè)定

在30 ℃、140 r·min-1條件下分別從反應(yīng)體系中取4 mL 菌液，用紫外分光光度計(jì)在600 nm 處測(cè)量吸光度[12]。菌群的OD600采用下式計(jì)算：

菌群OD600=樣品OD600-樣品上清液OD600-樣品BaP OD600

式中：樣品OD600指所取菌液的OD600，樣品上清液OD600指菌液在 12 000 r·min-1離心 2 min 后上清液的OD600。

1.4 降解率的測(cè)定

將全部培養(yǎng)液用等體積二氯甲烷振蕩萃取3 次，用玻璃注射器萃取液，通過0.45μm 濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中。PAHs 分析用Agilent-1200 高效液相色譜儀測(cè)定[13]，生物量用紫外檢測(cè)器（G1314B）測(cè)定，測(cè)定過程柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL·min-1，流動(dòng)相乙腈∶水=9∶1，參考《水質(zhì)多環(huán)芳烴的測(cè)定液液萃取和固相萃取高效液相色譜法》（HJ 478—2009），分別采用菲、芘、熒蒽和 BaP 的檢測(cè)波長(zhǎng) 251、240、232 nm 和290 nm，外標(biāo)法定量。

1.5 鹽度、酵母粉和pH對(duì)降解的影響

按照NaCl∶MgCl2·6H2O為20∶3配制不同鹽度、酵母粉濃度和不同pH 的培養(yǎng)基。滅菌后加BaP，使其初始濃度為30 mg·L-1。置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩，待丙酮揮發(fā)完，按照10%的比例接種菌液，30 ℃避光振蕩培養(yǎng)，15 d后測(cè)量BaP含量。

1.6 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

使用 MOBIO 公司的 PowerSoil?DNA Isolation Kit DNA 試劑提取盒提取DNA，采用細(xì)菌通用引物515F和 907R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，采用 Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行（上海美吉），并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)分析[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌群的富集和群落結(jié)構(gòu)

微生物降解 PAHs 主要集中在 3～4 環(huán)，5 環(huán) PAHs極難降解且具有高毒性，因此對(duì)BaP 降解的研究已經(jīng)成為PAHs 降解研究的熱點(diǎn)。本研究通過富集的方法，獲得了一個(gè)可以降解BaP 的微生物菌群。將該菌群接種到30 mg·L-1BaP 的培養(yǎng)基中，研究其降解和生長(zhǎng)情況（圖1）。菌群第3 d 對(duì)BaP 的降解率為7.3%，在第15 d 達(dá)到最高值，為33.34%。在第15～18 d，該菌群對(duì)BaP 的降解無明顯變化，可能是中間產(chǎn)物積累，抑制了菌群的降解[15]。Zhu 等[16]以 BaP 為唯一碳源和能源，從下水道沉積物中分離、篩選出4株BaP耐受菌株，其中一株Acinetobactersp.Bap30 能在20 d內(nèi)將40 mg·L-1的BaP 降解28.7%。從生長(zhǎng)曲線可以看出，菌群在BaP 存在時(shí)生長(zhǎng)緩慢，在第12 d 達(dá)到穩(wěn)定期，可能是中間代謝產(chǎn)物或者產(chǎn)生的有機(jī)酸抑制了菌體生長(zhǎng)[17]。

高通量測(cè)序結(jié)果（圖2）表明，該菌群主要由Ba?cillus、Zobellella、Gordonia、Rheinheimera等組成，它們所占比例分別是79.74%、5.92%、8.62%、1.05%。許多細(xì)菌、真菌及藻類都具有降解多環(huán)芳烴的能力[1]。Zhu 等[7]發(fā)現(xiàn)Brevibacillus可以在 7 d 降解 76% 的 BaP，并產(chǎn)生1-萘酚和2-萘酚。Guevara 等[18]分離了一株可以降解BaP的嗜熱菌Bacillus licheniformisM2-7，該菌可以表達(dá)鄰苯二酚雙加氧酶。Zobellella可以降解PAHs[19]，Gordonia可以降解芘、菲等[20]，但到目前為止，還沒發(fā)現(xiàn)Zobellella、Gordonia降解 BaP 的報(bào)道。截止到目前，共 22 株Rheinheimera被分離出來[21]，但還沒有該菌參與PAH 降解的報(bào)道。在本研究中，Ba?cillus是主要降解 BaP 的菌屬，Zobellella、Gordonia主要降解BaP的中間產(chǎn)物。

2.2 酵母粉添加量對(duì)BaP降解的影響

PAHs 是一類難降解污染物，分子量越大越難降解。共代謝是促進(jìn)微生物降解PAHs 的重要途徑[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，添加微量酵母粉可提高PAHs 的生物可降解性[22]。將富集出來的菌群接種到含30 mg·L-1BaP 的培養(yǎng)基中，研究酵母粉對(duì)菌群降解BaP 的影響。從圖3可以看出，在酵母提取物濃度小于80 mg·L-1的時(shí)候，BaP的降解率隨著酵母提取物濃度上升而上升，可能是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的增加提高了菌群的生物量，從而使得菌群對(duì)BaP 的降解率提高；也可能是酵母提取物提供了甜菜堿等相容性溶質(zhì)，提高了PAHs的生物可利用度[23]。當(dāng)酵母濃度為100 mg·L-1時(shí)，菌群對(duì)BaP 的降解率減少，可能是因?yàn)楣泊x底物濃度過高，與目標(biāo)污染物之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制作用[24]；或者酵母粉濃度過高抑制微生物合成降解PHAs 的酶[25]。有研究發(fā)現(xiàn)乳糖濃度過高抑制蒽降解，主要是因?yàn)槲⑸镞^度利用乳糖[26]。

2.3 pH對(duì)BaP降解的影響

pH 影響微生物的生長(zhǎng)和酶活性，有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 大于9 時(shí)，微生物的活性降低，使其生物修復(fù)效率明顯降低[2]。為了確定該菌群降解BaP 的最佳pH，本研究測(cè)定了不同pH 下菌群15 d后的BaP 降解率。由圖4 可以看出，pH 對(duì)于菌群的影響顯著，菌群更適宜在pH=7 的條件下生存，對(duì)BaP 的降解率為32.28%，在pH 大于7或小于7時(shí)，菌群對(duì)BaP 的降解率有明顯的下降趨勢(shì)。總體來說，該菌群更適合于在堿性條件下生存，在pH=10的條件下菌群對(duì)于BaP的降解率只有15.82%，酸性條件下抑制效果更強(qiáng)，在pH=4 時(shí)降解率只有9.09%。這可能是因?yàn)锽aP 降解會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸等中間產(chǎn)物，其在堿性環(huán)境中被中和，更利于微生物的生長(zhǎng)和降解[17]。但是在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中，pH會(huì)影響污染物的轉(zhuǎn)運(yùn)跨膜，菌群的降解功能受到嚴(yán)重抑制，影響B(tài)aP的降解。

2.4 菌群的降解廣譜性

該菌群除能降解BaP 外，還對(duì)其他的PAHs 有不同的降解能力。本試驗(yàn)研究了菌群對(duì)不同PAHs 降解廣譜性，由于不同PAHs 的毒性不同，本試驗(yàn)對(duì)不同PAHs設(shè)置了不同濃度，BaP初始濃度為30 mg·L-1，芘初始濃度為60 mg·L-1，熒蒽初始濃度為60 mg·L-1，菲初始濃度為100 mg·L-1。從圖5 可以看出，該菌群對(duì)熒蒽的降解十分明顯，降解率達(dá)到了99.8%。菌群對(duì)芘的降解效率達(dá)到了55.72%，但15 d 后菲只降解了38.51%。一般情況下，PAHs 的分子量越大，微生物越難降解。本研究中，該菌群對(duì)4 環(huán)的PAHs 降解效果最好，對(duì)熒蒽的降解達(dá)到99.8%，可能是萘羥基化雙加氧酶的活性“口袋”（活性中心）更適合4 環(huán)PAHs，BaP 分子量過大，不利于底物和活性中心內(nèi)的活性位點(diǎn)結(jié)合[27]?；钚灾行氖侨嵝缘陌紶睢翱诖?，具有一定的大小和形狀，和活性中心大小相近的PAHs才能進(jìn)入，分子量過大和過小都會(huì)降低酶的催化效率[27-28]。王慧等[22]分離出的Thalassospirasp.strain TSL5-2，可以降解菲、芘、熒蒽（20 mg·L-1）、苯并蒽（初始質(zhì)量濃度為8 mg·L-1），但不能降解苯并芘。本研究富集的微生物菌群，可以降解3～5 環(huán)的PAHs，尤其對(duì)熒蒽的降解效果最好，適用于PAHs 污染的修復(fù)。

2.5 鹽度對(duì)BaP降解的影響

鹽度是影響PAHs 降解能力的關(guān)鍵因素之一[29]。本試驗(yàn)研究了鹽度對(duì)該菌群降解BaP的影響。從圖6可以看出，該菌群在1%～8%鹽度下都能降解BaP，在對(duì)照和1%鹽度下對(duì)BaP 的降解效果十分明顯，達(dá)到了33.10%。但是隨著鹽度的升高，該菌群對(duì)BaP 的降解率逐漸降低，菌群的生物量也相應(yīng)降低，Minai-Tehran 等[30]研究生物降解在石油污染土壤中的處理效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，鹽度控制在0～1%的范圍內(nèi)，鹽度不會(huì)影響生物降解PAHs，但是當(dāng)超過這一限度時(shí)，菌群對(duì)于PAHs 的降解率隨著鹽度的升高而降低。生物量也隨著鹽度的升高而降低，高鹽導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、酶活性降低[31]，也導(dǎo)致滲透壓升高，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并引起代謝產(chǎn)物發(fā)生改變，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的滲透調(diào)劑物質(zhì)，導(dǎo)致降解率下降[32]。

3 結(jié)論

本文以BaP 為碳源在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中富集出來的降解菌群具有下列特性：

（1）該菌群主要由Bacillus、Zobellella、Gordonia、Rheinheimera等組成，其中Bacillus是主要的降解菌。

（2）在酵母提取物濃度為80 mg·L-1、pH=7、低鹽度下該菌群對(duì)BaP的降解效果最好。

（3）該菌群可以降解多種PAHs，其中對(duì)熒蒽的降解效果最好。