宋金云，王建芳，趙宏宇

乙型肝炎病毒(HBV)是一種部分雙鏈環(huán)狀DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，其基因組結(jié)構(gòu)獨(dú)特而精密，全長(zhǎng)約3.2 kb，包含4個(gè)開(kāi)放性讀碼框，即S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)，分別編碼外膜蛋白、核心蛋白、聚合酶和X蛋白。HBV感染呈世界性流行，雖然有高效的乙肝疫苗接種計(jì)劃，但HBV感染仍然是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，是全球慢性肝病和死亡的重要原因[1,2]。慢性HBV感染者有著不同的臨床表型，包括無(wú)癥狀攜帶狀態(tài)、急性肝炎、暴發(fā)性肝炎(肝衰竭)、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌[3]。影響HBV感染臨床進(jìn)程和預(yù)后的因素有HBV基因型、HBV DNA水平、特異性病毒突變、宿主的遺傳特征和環(huán)境因素等。其中，HBV基因型是決定慢性HBV感染者臨床預(yù)后的一個(gè)重要因素。同時(shí)，HBV基因型也可能影響對(duì)聚乙二醇干擾素α的治療應(yīng)答和HBeAg血清轉(zhuǎn)換[4]。本研究對(duì)295例慢性HBV感染者進(jìn)行了HBV基因分型，以探討它們與臨床表型和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 295例HBV感染者血清來(lái)自2015年6月～2018年5月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市第二醫(yī)院，其中慢性乙型肝炎261例，男112例，女149例，平均年齡為30.2±14.6歲；肝硬化30例，男21例，女9例，平均年齡為44.6±11.2歲；肝細(xì)胞癌4例，男3例，女1例，平均年齡為56.0±8.6歲。入選患者診斷符合2015年發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，所有患者均未接受過(guò)核苷(酸)類似物或α-干擾素治療，排除合并其他肝炎病毒感染、藥物性、自身免疫性和酒精性肝病。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(意見(jiàn)號(hào)：2019-LY-kt089)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 HBV基因分型 采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany)提取血清DNA。設(shè)計(jì)上游引物 5’-AGGCGGGGTTTTTCTTGTTGAC-3’(sense 201-222 )和下游引物 5’-AAAGGGACTCAAGATGTTGTAC-3’(antisense 790-769)，擴(kuò)增HBV DNA S區(qū)內(nèi)的590 bp片段。PCR 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 3 min，94℃ 變性 30 s，58℃ 退火45 s，72℃ 延伸 45 s，32個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 延伸10 min。PCR 擴(kuò)增后，采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Germany) 純化PCR 產(chǎn)物，使用BigDye Terminator v3.1cycle sequencing kit(Applied Biosystems)在ABI PRISM 3100 Genetic Analyze上直接對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。對(duì)獲得的測(cè)序序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站分型窗口(http://www.nvbi.nlm.gov/projects/genotyping/formp age.cgi )進(jìn)行HBV基因分型。

1.3 血清檢測(cè) 使用i2000型化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑盒(定標(biāo)品和質(zhì)控品為試劑盒自帶，美國(guó)雅培公司)檢查血清HBV標(biāo)記物(HBsAg ≥ 0.05 IU/mL、HBsAb ≥ 10 mIU/mL、HBeAg ≥1.0S/CO、HBeAb≤ 1.0 S/CO和HBcAb ≥1.0 S/CO判為陽(yáng)性)；使用日立7600-120全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血生化指標(biāo)；采用放射免疫法檢測(cè)血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、IV型膠原(CIV)和III型前膠原N端肽(PIIINP)；使用ABI7300熒光定量PCR檢測(cè)儀(美國(guó)應(yīng)用生物公司)和 HBV DNA定量檢測(cè)試劑盒(深圳匹基生物工程有限公司)檢測(cè)血清HBV DNA(檢測(cè)范圍為500 IU/mL～1×108IU/mL。當(dāng)HBV DNA≥500 IU/mL時(shí)，按實(shí)際檢測(cè)結(jié)果計(jì)算，當(dāng)其<500 IU/mL時(shí)，均報(bào)告為小于最低檢測(cè)線)。

2 結(jié)果

2.1 不同血清標(biāo)志物陽(yáng)性患者HBV基因分型情況 在295例HBV感染患者中，有132例(44.7%)為B型感染，161例(54.6%)為C型感染，2例(0.7%)為D型感染。7種不同HBV血清學(xué)標(biāo)志物陽(yáng)性患者HBV基因分型情況見(jiàn)表1。

表1 不同血清HBV標(biāo)記物陽(yáng)性患者HBV B型和C型流行率(%)比較

2.2 慢性乙型肝炎和肝硬化患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 慢性乙型肝炎患者與肝硬化患者血清TBIL、ALT和AST水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)；肝硬化患者血清肝纖維化指標(biāo)顯著高于慢性乙型肝炎患者(P<0.05)；肝硬化患者血清HBV DNA載量顯著高于慢性乙型肝炎患者(P<0.05)，血清HBeAg陽(yáng)性率顯著高于慢性乙型肝炎患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.798，P<0.05，表2)。

2.3 不同臨床表型患者HBV基因型比較 在295例HBV感染者中，慢性乙型肝炎261例，肝硬化30例，肝細(xì)胞癌4例。肝硬化患者和肝細(xì)胞癌患者C型比例顯著高于慢性乙型肝炎患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表2 慢性乙型肝炎和肝硬化患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

表3 不同臨床表型患者HBV基因型構(gòu)成比(%)比較

3 討論

乙型病毒性肝炎呈全球性分布，是嚴(yán)重危害人類身體健康的傳染性疾病。在我國(guó)，HBV感染尤為突出，肝硬化和肝癌大部分與慢性HBV感染有關(guān)，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)生活帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。多種因素影響HBV感染后的臨床轉(zhuǎn)歸，HBV基因型可能是其中重要的因素之一，與臨床預(yù)后密切相關(guān)，且不同基因型具有不同的致病性[6]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到HBV基因分型的臨床重要性，對(duì)HBV基因型的研究也越來(lái)越深入。根據(jù)HBV核苷酸全序列異質(zhì)性≥8%或S基因序列≥4%，可將HBV分為10個(gè)基因型，包括A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型、H型、I型和J型[7]。大量研究表明，HBV基因型分布具有明顯的地理區(qū)域性差異，A型流行于北歐、非洲和印度，B型和C型主要分布在中國(guó)、韓國(guó)和東南亞，D型主要在歐洲、北非、俄羅斯、中東和印度次大陸流行，E型、F型、G型、H型、I型和J型主要發(fā)現(xiàn)于西非、中美洲和南美洲、美國(guó)、中美洲、越南和日本[8]。我國(guó)HBV基因型主要以B型和C型為主，這兩種基因型的慢性肝病患者病情嚴(yán)重程度各不相同，多數(shù)研究結(jié)果顯示C型患者比B型患者具有更為嚴(yán)重的肝損傷，C型患者更容易發(fā)生晚期纖維化、肝硬化和肝癌[9-11]。

本研究通過(guò)對(duì)295例HBV感染患者血清病毒基因型分析，發(fā)現(xiàn)B型有132例，占44.7%；C型有161例，占54.6%；D型有2例，占0.7%，說(shuō)明HBV基因型以B型和C型為主，且C型略高于B型。HBsAb作為一種保護(hù)性抗體，可中和HBsAg。血清HBsAb陽(yáng)性意味著對(duì)HBV有免疫力。一般情況下，HBsAg和HBsAb不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性，但在實(shí)際臨床工作中還是發(fā)現(xiàn)一部分患者血清標(biāo)志物HBsAg和HBsAb同時(shí)陽(yáng)性的現(xiàn)象。本組295例HBV患者中有七種HBV血清學(xué)標(biāo)志物陽(yáng)性組成模式，模式1和模式2是HBV感染患者最常見(jiàn)的血清學(xué)標(biāo)志物陽(yáng)性組成模式。在模式3和模式4中出現(xiàn)了HBsAg和HBsAb同時(shí)陽(yáng)性的現(xiàn)象，可能由于不同亞型感染或者S基因氨基酸序列發(fā)生突變形成免疫逃逸或免疫耐受[12]。

肝纖維化是慢性肝炎發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)階段。有研究顯示肝纖維化的長(zhǎng)期持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化和肝癌[13,14]。HA，LN，CIV和PIIINP是與肝臟炎癥嚴(yán)重程度相關(guān)的四個(gè)肝纖維化血清標(biāo)志物，可以反映膠原合成狀態(tài)，是臨床上對(duì)肝纖維化有較高診斷價(jià)值的參考指標(biāo)[15]。HA為高分子多糖，由肝內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞合成，是構(gòu)成肝細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在肝臟慢性炎癥過(guò)程中，HA合成增多，而肝細(xì)胞對(duì)HA的降解能力降低。LN是非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白，是基底膜的主要成分之一，主要由肝臟內(nèi)皮細(xì)胞合成，可以反映肝纖維化的進(jìn)展和嚴(yán)重程度。CIV是一種纖維狀糖蛋白，是構(gòu)成基底膜的重要成分，當(dāng)基底膜遭受破壞時(shí)，CIV明顯增加，可較靈敏地反映出肝纖維化過(guò)程。PIIINP是III型前膠原分泌到細(xì)胞外被肽酶切下的N端肽，能特異地反映III型前膠原的代謝水平，敏感地提示肝內(nèi)纖維化程度。本研發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清HA、LN、CIV和PIIINP水平均顯著高于慢性乙型肝炎患者(P<0.05)。

HBV DNA 和HBeAg 分別是衡量HBV復(fù)制能力和傳染性的主要病毒學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)[16,17]，兩者是評(píng)估HBV感染患者體內(nèi)病毒感染狀況、病情進(jìn)展和預(yù)后的重要指標(biāo)。HBV持續(xù)復(fù)制和肝臟炎性壞死是肝炎肝硬化病情進(jìn)展的主要決定性因素。目前，普遍認(rèn)為C型比B型感染者HBeAg陽(yáng)性率更高，引起的肝臟炎性壞死更嚴(yán)重，且C型與肝硬化和肝細(xì)胞癌相關(guān)，可能與C型HBV復(fù)制能力和變異能力較強(qiáng)，能夠逃避宿主免疫攻擊和藥物雙重壓力，從而維持持久的病毒血癥有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，肝硬化患者血清HBV DNA載量為(6.4±1.8) lg copies/ml，HBeAg陽(yáng)性率為90.0%(27/30)，顯著高于慢性乙型肝炎患者，差異具有顯著性(P<0.05)。在295例HBV感染者中，肝硬化和肝細(xì)胞癌共有34例，慢性乙型肝炎有261例，肝硬化患者和肝細(xì)胞癌患者中C型感染所占比例分別為73.3%(22/30)和75%(3/4)，均高于慢性乙型肝炎患者的52.1%(136/261)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明C型感染患者比B型患者更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的肝臟炎癥和組織損傷，預(yù)后更差，與既往大多數(shù)研究結(jié)果一致[18-20]。

HBV基因型與慢性乙型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)展、治療療效和臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)。本文結(jié)果表明，慢性乙型肝炎和肝硬化患者感染HBV基因型以B型和C型為主，以C型居多。C型感染患者比B型感染患者更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的肝損傷，并產(chǎn)生不良的臨床結(jié)局。本研究有助于更好地了解HBV基因型分布，為HBV相關(guān)肝病的防治提供臨床流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為指導(dǎo)臨床對(duì)乙型肝炎進(jìn)展的判斷和臨床用藥提供依據(jù)。