王憲剛，張永，周麗，李先華

慢性阻塞性肺疾病(COPD)目前是世界上第四大死因[1]。2012年，超過300萬人死于COPD，占全球死亡人數(shù)的6%，COPD已是世界各地慢性發(fā)病率和病死率的主要原因。在全球范圍內，由于持續(xù)暴露于COPD危險因素和人口老齡化，預計未來幾十年的COPD負擔將增加，該病已對全球造成巨大的經濟負擔，因此對COPD進行一系列的深入研究已迫在眉睫。GOLD全球診治倡議指出COPD是一種炎癥性疾病，全身性糖皮質激素治療住院治療的COPD急性加重期(AECOPD)患者或在急診科就診期間，已被證明可降低治療失敗率、復發(fā)率，改善肺功能和呼吸困難[2]。糖皮質激素是通過與其受體結合發(fā)揮抗炎活性，而糖皮質激素受體(GR)基因存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)則可能影響受體親和力。本研究對糖皮質激素受體基因D641V、R477H的多態(tài)性進行分析，并綜合文獻分析糖皮質激素受體基因多態(tài)性可能影響激素治療的敏感性?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017-2018年四川省內江市第一人民醫(yī)院收治的AECOPD患者81例，男60例，女21例；年齡55～85(70.21±5.21)歲；體質量50～70(60.12±2.42)kg，體質指數(shù)(21.24±1.57)kg/m2?；颊呷朐汉蠓喂δ軝z查：FEV1/FVC均<70%，F(xiàn)EV1占預計值百分比(FEV1%)(35.84±19.04)%?；颊叻喂δ軝z查均在吸入支氣管擴張劑后進行。體格檢查、胸部X線片(胸部CT)、肺功能、動脈血氣分析、血常規(guī)等檢查符合AECOPD的診斷標準[3]。既往及現(xiàn)病史均無免疫性疾病、過敏性疾病史，無心腦血管疾病、心力衰竭、高血壓、腎功能不全、癌癥等嚴重疾病。患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 基因組DNA檢測試劑盒(美基生物)；qPCR試劑盒：Probe FAST qPCR Kit Master Mix(2×) Universal(KAPA Biosystems)。肺功能檢測儀(日本美能AS-507)；NAS-99分光光度計(ACTGene公司)；ABI7900HT實時定量PCR儀(ABI公司)；MGB探針(上?；倒竞铣?。

1.3 方法 81例患者入院時均采集靜脈血2 ml，檢測糖皮質激素受體D641V、R477H基因多態(tài)性。采用磁珠法試劑盒進行基因組DNA提取，DNA濃度與純度使用紫外分光光度計測定。GR基因的不同的SNP位點分別設計1對PCR引物和TaqMan探針，實時熒光PCR擴增，探針的5′端和3′端分別標記1個報告熒光基團和1個淬滅熒光基團，PCR擴增引物和探針熒光染料及序列見表1。PCR反應體系：KAPA SYBR FAST Master Mix(2×)Universal 5 μl，Primer F 0.2 μl，Primer R 0.2 μl，Probe1 0.25 μl，Probe2 0.25 μl，ROX 0.2 μl，DNA 1 μl，H2O補齊至10 μl。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃復性、延伸1 min，40個循環(huán)。使用定量軟件導出原始數(shù)據及散點圖，分析基因類型。

表1 PCR擴增引物和MGB探針熒光序列及染料

2 結 果

2.1 D641V基因多態(tài)性分析 糖皮質激素受體基因D641V位點的SNP號是rs104893908，等位基因為A/T，野生型基因AA，雜合子為AT，突變型為TT。Real-time PCR可見等位基因A的擴增曲線，未見等位基因T的擴增曲線，原始數(shù)據及散點圖(圖1)導入定量軟件中分析，D641V位點的檢測結果：AA型81例，AT型0例，TT型0例。

2.2 R477H基因多態(tài)性分析 糖皮質激素受體基因R477H位點的SNP號是rs104893913，等位基因為G/A，野生型基因GG，雜合子為GA，突變型為AA。Real-time PCR可見等位基因G的擴增曲線，未見等位基因A的擴增曲線，原始數(shù)據及散點圖(圖1)導入定量軟件中分析。R477H位點的檢測結果：GG型81例，GA型0例，AA型0例。

圖1 rs104893908、rs104893913等位基因PCR擴增散點圖

3 討 論

1999年，核受體委員會將糖皮質激素受體及其基因正式命名為Nuclear receptor subfamily 3,group C,member 1(縮寫：NR3C1)[4]，GR為核受體超家族成員之一。臨床上存在糖皮質激素療效差異的現(xiàn)象，部分出現(xiàn)明顯的糖皮質激素抵抗。糖皮質激素敏感性降低的分子機制包括GR基因多態(tài)性及突變、GR表達水平降低、GR表達的不同亞型、GR復合物的分子伴侶等因素，其中GR基因多態(tài)性對糖皮質激素抵抗的作用可能被低估[5-6]。Hurley等[7]最先在家族性糖皮質激素抵抗患者中單獨發(fā)現(xiàn)核苷酸2054 T>A，這種堿基變化導致氨基酸在糖皮質激素受體蛋白的641位置發(fā)生改變，天冬氨酸密碼子(GAC)改為纈氨酸密碼子(GTC)，其中突變純合子TT型表現(xiàn)出嚴重的糖皮質激素抵抗，雜合子親屬僅有輕微的糖皮質激素影響。Ruiz等[8]發(fā)現(xiàn)有雜合的錯義突變R477H，GR與激素結合后向核內的遷移減緩,失去轉錄激活功能。

雖然先后有學者發(fā)現(xiàn)D641V、R477H的SNPs影響糖皮質激素的療效，COPD患者是否存在同樣情況卻存在疑問。部分使用較大劑量的糖皮質激素仍不能有較好療效，其影響因素可能是多方面的，可能有復雜的機制。氣道的慢性炎性反應不僅參與COPD的發(fā)病機制，還可能誘導糖皮質激素抵抗[9]；在肺泡巨噬細胞和T淋巴細胞中，上調GR-α和下調GR-β可提高激素敏感性，提示GR亞型可顯著影響糖皮質激素的敏感性[10]；另外，GR的翻譯后修飾，特別是GR磷酸化，同樣可影響其對糖皮質激素的活性[11-12]。除去以上研究方向，鮮有學者研究COPD患者GR的SNPs與糖皮質激素的敏感性。

在支氣管哮喘患者的糖皮質激素抵抗中，GR的SNPs研究相對深入。Ruiz等[8]不僅發(fā)現(xiàn)R477H突變,還進一步發(fā)現(xiàn)R477H野生型GG頻率在哮喘抵抗患者中明顯更低[13]，且R477H天然突變體通過影響GR的不同功能而引起廣泛的糖皮質激素抵抗，這些功能跨越GR信號的級聯(lián)系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)[14]。我國學者趙峰等[15-16]研究了激素抵抗型哮喘患者的糖皮質激素受體R477H、D641V的基因多態(tài)性，在抵抗型患者中R477H的GA、AA基因型數(shù)量明顯高于敏感組和對照組，提示等位基因A可能是激素抵抗產生的因素。同樣在D641V上等位基因T的頻率高于敏感組和對照組，提示等位基因T可能是激素抵抗產生的原因。表明GR受體基因多態(tài)可能明顯影響糖皮質激素在哮喘患者中的敏感性。既然在激素抵抗的哮喘患者發(fā)現(xiàn)存在GR基因多態(tài)性，預示COPD患者也可能存在GR基因多態(tài)性影響糖皮質激素的敏感性。

本研究就AECOPD患者的糖皮質激素受體基因位點D641V、R477H進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)其基因均為野生型，未發(fā)現(xiàn)突變基因，說明D641V、R477H在COPD患者中可能突變率低，也可能與樣本量小相關，需擴大樣本量，并積極分析GR基因的其他單核苷酸多態(tài)，進一步研究GR基因多態(tài)性可能影響COPD患者糖皮質激素的敏感性。