王 成，于 航，姚衛(wèi)蓉，成玉梁，郭亞輝，錢 和，譚志強(qiáng)，謝云飛*

1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122 2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

引 言

雙氯芬酸鈉(Diclofenac sodium)是一種非甾體抗炎藥，常被用于疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和某些非風(fēng)濕性疾病，其對(duì)哺乳動(dòng)物有多重負(fù)面影響，包括心毒性、肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、基因毒性和血液毒性[1]。

目前，非甾體抗炎藥在獸藥中被廣泛使用?？梢杂靡合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定牛奶[2]、豬肉和雞蛋中的雙氯芬酸鈉[3]。從廢水、尿液、牛乳和血漿中使用電膜萃取作為酸性化合物的雙氯芬酸鈉，并采用高效液相色譜法進(jìn)行定量分析[4]。同時(shí)，雙氯芬酸鈉在水體中降解性差，在污水處理中不易被處理，對(duì)水生生物如魚(yú)類、貽貝等具有潛在毒性[5]。以AgMBA@SiO2-Ab為免疫探針，采用基于表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)的免疫層析法可以快速、定量、超敏檢測(cè)水樣中的雙氯芬酸[6]。這些實(shí)驗(yàn)方法都要做較多前處理實(shí)，比較耗時(shí)。近紅外光譜結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)無(wú)損定量分析雙氯芬酸鈉粉體[7]的方法在一次檢測(cè)中也需要大量的實(shí)驗(yàn)樣品。

雖然近紅外是一種有效的無(wú)損檢測(cè)手段，但是不能提供被測(cè)物質(zhì)的空間信息及化學(xué)信息的變化。相較之下，近紅外高光譜成像(near-infrared hyper spectral imaging，NIR-HSI)將計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)和傳統(tǒng)的近紅外技術(shù)結(jié)合，可以同時(shí)采集待測(cè)物的空間信息和化學(xué)信息。近紅外高光譜成像技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域已有研究，在近紅外區(qū)間(990～1 700 nm)建立并評(píng)價(jià)自特征提取的深度學(xué)習(xí)模型用于無(wú)損檢測(cè)摻假紅肉產(chǎn)品[8]或鑒別轉(zhuǎn)基因大豆。利用NIR-HIS在990～1 700 nm結(jié)合光譜相似性測(cè)量方法[9]、偏最小二乘法[10]、波段比[11]方法分析了奶粉中非法添加三聚氰胺。NIR-HSI用于研究了無(wú)損定量檢測(cè)花生籽粒中的油和蛋白質(zhì)含量以及鴨梨中檢測(cè)可溶性固形物含量[12]。嘗試近紅外高光譜成像技術(shù)與紫外分光光度法結(jié)合來(lái)估計(jì)大麥麥芽中酚類化合物的濃度[13]。

本文主要是探索利用近紅外高光譜成像(1 000～2 500 nm)無(wú)損、快速檢測(cè)緩解炎癥保健食品中違禁添加的化學(xué)物質(zhì)的方法，闡述近紅外高光譜成像技術(shù)在快速定量檢測(cè)保健食品中違禁添加抗炎藥物雙氯芬酸鈉的可能性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品

實(shí)驗(yàn)用緩解炎癥保健食品從Perth WA Australia代購(gòu)，沒(méi)有任何化學(xué)預(yù)處理。雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(99%從上海Macklin)購(gòu)買。保健食品和雙氯芬酸鈉混合物作為訓(xùn)練集的樣本濃度(W/W)分別為0.01%，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.20%，0.40%，0.80%，1.00%，2.00%，4.00%，6.00%，8.00%，10.00%，12.00%，14.00%，16.00%，18.00%和20.00%，每個(gè)濃度樣品各3組(編號(hào)1—20)，共60個(gè)樣本。測(cè)試集的混合物濃度(W/W)為0.05%，0.50%，1.50%，5.00%，11.00%，15.00%每個(gè)樣品濃度各3組(編號(hào)CK1—6)，共18個(gè)樣本。保健食品粉碎后，樣品濃度(W/W)低于0.02%的混合物稱取10 g，其他濃度樣品混合物各稱取6.7 g，稱好放入50 mL離心管中在振蕩器上混合均勻。將混合樣品取出裝滿塑料培養(yǎng)皿(直徑30 mm×厚度10 mm)中，輕輕振蕩使得樣品表面平整。同一樣品重復(fù)兩次測(cè)量光譜數(shù)據(jù)。

1.2 高光譜成像系統(tǒng)

采用GaiaSorter-N25E室內(nèi)近紅外高光譜成像系統(tǒng)(四川雙利合譜科技有限公司)，高光譜設(shè)備主要由四個(gè)部分組成，包括短波紅外高光譜相機(jī)、光源、樣品置物臺(tái)和計(jì)算機(jī)。其中光源是由2套50W鹵素?zé)艄庠唇M成，兩組光源被安置在平臺(tái)兩側(cè)，光源高度為25 cm，安裝角度為30°。短波紅外高光譜相機(jī)包括芬蘭Specim公司的Imspector系列成像光譜儀和MCT探測(cè)器，波段范圍為982～2 591 nm，光譜分辨率為12 nm(288個(gè)波長(zhǎng))。高光譜相機(jī)的曝光時(shí)間設(shè)置為8 ms，樣品放置在電機(jī)移動(dòng)平臺(tái)上，移動(dòng)范圍9～27 cm，在成像系統(tǒng)視場(chǎng)范圍內(nèi)對(duì)樣品逐行掃描，步進(jìn)電機(jī)由相連的計(jì)算機(jī)控制，掃描前進(jìn)的電機(jī)速率為0.8 cm·s-1。利用光譜圖像軟件實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。

此外，為了獲得較穩(wěn)定和有可比性的模型數(shù)據(jù)，還需要使用兩個(gè)額外的圖像:一個(gè)暗電流圖像(D)和一個(gè)白色參考圖像(W)來(lái)校正原始獲得的圖像(R0)[14]。反射率大約為0%的暗電流圖像(D)是通過(guò)用不透明的遮光罩完全覆蓋攝像機(jī)鏡頭獲得的，而漫反射系數(shù)為～99.9%的白色參考圖像(W)，校正公示為

(1)

所有的暗板，白板都由系統(tǒng)自帶，通過(guò)高光譜軟件獲得校正光譜數(shù)據(jù)。

1.3 高光譜數(shù)據(jù)分析

對(duì)采集的高光譜圖像由ENVI4.8軟件(ITT Visual Information Solutions,Boulder,CO,USA)提取和計(jì)算感興趣區(qū)域的平均光譜數(shù)據(jù)，選擇1 000～2 524 nm波段及特征波段的光譜作為定量分析的輸入變量。

光譜數(shù)據(jù)包含的信息比較豐富，大量的信息會(huì)包含各種各樣的隨機(jī)噪聲，相機(jī)暗電流等，會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生較大影響[15]。在建立模型前對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理是有必要的，可以減少噪聲及外界的影響。主要的預(yù)處理方式有移動(dòng)平均法(moving average，MA)，高斯濾波(Gaussian filter，GF)，中值濾波(median filter，MF)，歸一化(normalize)，卷積平滑(savitzky-golay smoothing，SG-Smoothing),標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量(standard normal variate，SNV)，基線處理(baseline)，多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)。數(shù)據(jù)的預(yù)處理和分析都使用The Unscrambler X10.4(CAMO Software AS,Norway)。

使用三種線性回歸的模型，包括偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)，主成分回歸分析(principal component regression，PCR)及多元線性回歸(multiple linear regression，MLR)模型。

(1) PLSR模型

建立PLSR模型，將樣本的光譜與違禁添加物的濃度聯(lián)系起來(lái)。當(dāng)被測(cè)變量眾多且高度共線(相關(guān))時(shí)，PLSR成為構(gòu)建模型的最穩(wěn)健、最可靠的化學(xué)計(jì)量方法。通過(guò)PLSR找出自變量(X)與因變量(C)之間的基本關(guān)系，從而將原來(lái)的預(yù)測(cè)因子簡(jiǎn)化為主成分因子(LVs)的新變量集，該變量矩陣具有最佳的預(yù)測(cè)能力[16]。這些LVs在統(tǒng)計(jì)上是獨(dú)立的，即不相關(guān)，為了防止模型出現(xiàn)過(guò)擬合或欠擬合，要選擇最優(yōu)的Lvs的數(shù)量[17]，在本文使用內(nèi)部交叉驗(yàn)證(cross-validation，CV)過(guò)程中使用均方根(root-mean-square,RMS)的最小值來(lái)選擇LVs的最優(yōu)數(shù)量。PLSR中自變量(X)與因變量(C)的基本關(guān)系可以用式(2)來(lái)表示

C=B1X1+B2X2+…+BnXn+B0

(2)

式(2)中，C為雙氯芬酸鈉的濃度，B1—Bn是272個(gè)波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)，X1—Xn為每個(gè)濃度樣本的光譜，B0是回歸系數(shù)的截距。

(2) PCR模型

PCR分成兩步，首先對(duì)光譜矩陣進(jìn)行主成分分析，得到少數(shù)原始光譜矩陣的線性組合變量，并將數(shù)據(jù)的最大方差投影到新的坐標(biāo)，選取出重要的主成分?jǐn)?shù)，進(jìn)行多元線性回歸。

(3) MLR模型

多元線性回歸模型用于確定多個(gè)自變量的組合來(lái)共同估計(jì)因變量，本研究需要選擇好特征光譜波長(zhǎng)或區(qū)間建立模型預(yù)測(cè)保健食品中混合的雙氯芬酸鈉的含量，MLR的公式如式(2)。

1.4 選擇特征波段

高光譜圖像中的信息量豐富，存在高維的、多共線性的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性降低的問(wèn)題。因此，找出特征波段，利用有效的特征波段信息與雙氯芬酸鈉的含量建立關(guān)系，提高模型準(zhǔn)確性很有必要。采用基于PLSR模型加權(quán)回歸系數(shù)從全光譜范圍中選擇特征波長(zhǎng)[12]。加權(quán)回歸系數(shù)的方法,也稱為β系數(shù)方法，用產(chǎn)生的絕對(duì)值大的回歸系數(shù)作為最佳波段并建立MLR模型。

1.5 模型評(píng)價(jià)

(3)

(4)

(5)

式中，n是樣品數(shù)，Ycal是樣品的訓(xùn)練值，Ypi是樣品的預(yù)測(cè)值，Yti是樣品參考真實(shí)值，Ym是樣品參考的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙氯芬酸鈉的近紅外高光譜分析

提取雙氯芬酸鈉(Diclofenac)、緩解炎癥保健食品(KB)、緩解炎癥保健食品中不同含量的雙氯芬酸鈉混合物(編號(hào)1—20)的平均原始譜圖(提取面積為直徑30 mm培養(yǎng)皿樣品表面的ROI)，如圖1所示。從圖1可以看出雙氯芬酸鈉的吸收峰與緩解炎癥保健食品的吸收峰位置有明顯區(qū)別，即平均光譜圖中雙氯芬酸鈉的吸收峰在1 141，1 507和1 675 nm為XH(C，N，O)第一泛音、伸縮振動(dòng)及XH(C，N，O)合頻，2 161和2 407 nm為組合頻吸收[18]。緩解炎癥保健食品與緩解炎癥保健食品中摻有不同含量的雙氯芬酸鈉混合物的平均原始光譜無(wú)法區(qū)分。

圖1 雙氯芬酸鈉(Diclofenac)、緩解炎癥保健食品(KB)、緩解炎癥保健食品中不同含量的雙氯芬酸鈉混合物(編號(hào)1—20)的平均原始譜圖Fig.1 Mean original spectra of Diclofenac Sodium，Anti-inflammatory dietary supplements (KB),different concentrations of diclofenac sodium compounds (No.1—20) in inflammation-reducing dietary supplements

圖2中是三組雙氯芬酸鈉(Diclofenac)、緩解炎癥保健食品(KB)及緩解炎癥保健食品中摻有不同含量的雙氯芬酸鈉混合物(編號(hào)1—20)的平行樣品在雙氯芬酸鈉的特征波長(zhǎng)1 675 nm處的成像圖。雙氯芬酸鈉和緩解炎癥保健食品的圖像有一定程度的差異，但兩者混合物的成像圖無(wú)法肉眼識(shí)別其中雙氯芬酸鈉的含量，需要進(jìn)一步的方法進(jìn)行區(qū)分。

圖2 1 675 nm處緩解炎癥保健食品(KB)、雙氯芬酸鈉(Diclofenac sodium)及緩解炎癥保健食品中0.01%～20%含量的雙氯芬酸鈉高光譜成像圖Fig.2 Hyperspectral images of 0.01%～20% Diclofenac sodium in anti-inflammatory dietary supplements (KB), anti-inflammatory dietary supplements and Diclofenac sodium (Diclofenac) at 1 675 nm

2.2 不同建模方法的比較分析

編號(hào)1—20的120個(gè)樣品中隨機(jī)選擇104個(gè)樣品光譜作為訓(xùn)練集并使用內(nèi)部交叉驗(yàn)證，編號(hào)CK的36個(gè)樣品中隨機(jī)選擇30個(gè)樣品光譜作為測(cè)試集。為了比較不同建模方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，主要使用上述8種處理光譜數(shù)據(jù)并建立了PLSR，PCR和MLR三種模型，獲得了校正集、驗(yàn)證集、測(cè)試集模型的R2，RMSE等相關(guān)參數(shù)。

2.2.1 PLSR模型

表1 基于全光譜波長(zhǎng)的PLSR模型Table 1 PLSR model based on full spectral wavelength

2.2.2 PCR模型

表2 基于全波長(zhǎng)的PCR模型Table 2 PCR model based on full spectral wavelength

2.2.3 MLR模型

表3 基于最佳波段建立MLR模型Table 3 MLR model based on optimal spectral band

圖3 偏最小二乘回歸(PLSR)模型中β回歸系數(shù)權(quán)值占比選擇較優(yōu)波段Fig.3 Selection of the optimal spectral bands by weight ratio of β regression coefficients in the partial least squares regression (PLSR) model

2.3 預(yù)測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證

表4顯示了PLSR，MLR和PCR三種模型平均預(yù)測(cè)值與真實(shí)值，其中MLR模型預(yù)測(cè)的雙氯芬酸鈉含量較低(0.05%)時(shí)，平均預(yù)測(cè)值比真實(shí)值偏高，但兩者相差較小，雙氯芬酸鈉含量較高時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果更接近真實(shí)值。PLSR，PCR模型預(yù)測(cè)雙氯芬酸鈉含量低于0.5%時(shí)的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值相差較大。在高濃度時(shí)，后兩個(gè)模型預(yù)測(cè)能力相對(duì)MLR模型稍差。所以，MLR模型預(yù)測(cè)不同濃度的雙氯芬酸鈉的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較好，預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)。

表4 PLSR，PCR，MLR模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值比較Table 4 The predictive values of PLSR,PCR and MLR models compared with real value

3 結(jié) 論

探討了近紅外高光譜成像技術(shù)在緩解炎癥保健食品中添加不同含量抗炎類藥物雙氯芬酸鈉的無(wú)損檢測(cè)分析。使用了8種不同的光譜預(yù)處理方法，建立了全光譜PLSR和PCR模型，利用β系數(shù)方法選擇最優(yōu)波段1 130～1 147，1 412～1 468，1 658～1 709，2 010～2 055，2 122～2 178和2 395～2 423 nm，經(jīng)SNV預(yù)處理方法建立的MLR模型，預(yù)測(cè)最低限為0.05%，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的R2為0.992 5，RMSECP為0.004 9，SEP為0.004 9。綜上所述，說(shuō)明近紅外高光譜成像技術(shù)可用于快速、定量檢測(cè)分析緩解炎癥保健食品中違禁添加的雙氯芬酸鈉，有巨大應(yīng)用潛力。