閆 帥，李永玉*，彭彥昆，劉亞超，韓東海

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心，北京 100083 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083

引 言

表面增強拉曼散射(surface-enhancement of Raman scattering)是某些物質(zhì)分子吸附到特定的金屬表面時，該分子拉曼散射強度顯著增強的一種現(xiàn)象[1]。表面增強拉曼光譜可以快速提取樣品的指紋特征信息，無需制備特殊樣品，廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品、食品[2-4]等安全、品質(zhì)方面痕量甚至單分子的檢測應(yīng)用研究。但表面增強拉曼光譜信號重復(fù)性欠佳，定量分析局限于實驗室固定檢測條件下的應(yīng)用研究，仍亟待發(fā)展完善[5]。

拉曼信號重復(fù)性受諸多因素的影響，如檢測環(huán)境溫度、被測物質(zhì)與探針之間相對位置、檢測器件的暗電流噪聲、光源的輸出功率穩(wěn)定性等[6]。特別是表面增強拉曼信號重復(fù)性更差，不同批次的表面增強劑以及表面增強劑與樣品的混合時間等均對拉曼信號強度影響非常大。為消除或減少上述的影響，諸多學(xué)者通過內(nèi)標(biāo)法進行了拉曼光譜定量分析研究，旨在提高定量預(yù)測模型的精度。劉江美[7]等通過加入硫氰化鉀作為內(nèi)標(biāo)物對亞胺硫磷溶液進行表面增強拉曼光譜分析；房曉倩[8]等以硝酸鈉1 053 cm-1處拉曼特征峰強作內(nèi)標(biāo)建立了山梨酸鉀濃度預(yù)測模型并進行預(yù)測；Yu[9]等以丙酮為誘導(dǎo)物浸漬樣品皮提取農(nóng)藥分子，并將丙酮的拉曼特征峰作為內(nèi)標(biāo)校準了拉曼信號波動。除此之外還有以四氯化碳、高氯酸根離子[10]、甲醇[11]等為內(nèi)標(biāo)物的相關(guān)研究報道。以上研究一定程度上減小或消除拉曼信號穩(wěn)定性差的問題，提高了定量分析模型精度，但均引入了額外的內(nèi)標(biāo)化學(xué)物質(zhì)。如果被測底物本身持有固有的內(nèi)標(biāo)峰，無需加入額外的內(nèi)標(biāo)物，可避免引入新內(nèi)標(biāo)時的人為誤差，也可消除或減少拉曼信號重復(fù)性差的問題。

蜂蜜作為傳統(tǒng)的營養(yǎng)保健食品，其品質(zhì)安全備受關(guān)注。硝基呋喃類抗生素應(yīng)用于治療或預(yù)防蜜蜂的胃腸道疾病具有潛在殘留風(fēng)險。本文以蜂蜜中硝基呋喃妥因獸藥為檢測對象，利用實驗室自行搭建的拉曼點檢測系統(tǒng)，確認作為底物蜂蜜的固有內(nèi)標(biāo)峰，分析硝基呋喃妥因拉曼特征峰的歸屬，研究基于蜂蜜固有內(nèi)標(biāo)的硝基呋喃妥因表面增強拉曼特征峰強校正方法，建立蜂蜜中硝基呋喃妥因獸藥殘留的定量預(yù)測模型，旨在消除和減少儀器系統(tǒng)誤差及表面增強過程中不可控因素引起的人為誤差，為蜂蜜中獸藥殘留定量分析提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

棗花蜂蜜購于北京市當(dāng)?shù)匚锩莱?，用于制備含硝基呋喃妥因蜂蜜樣品；硝基呋喃妥?高純，98%)購于上海源葉生物科技有限公司用于獲取硝基呋喃妥因標(biāo)準拉曼光譜和制備含硝基呋喃妥因蜂蜜樣品；檸檬酸鈉(分析純，北京化工廠)和硝酸銀(分析純，廣東光華科技股份有限公司)用于制備表面增強劑銀溶膠。

拉曼光譜系統(tǒng)為實驗室自行搭建的拉曼光譜點檢測系統(tǒng)，包括Andor CCD相機(Andor Technology，Inc，South Windsor，Conn)，光譜儀(Head Wall Photonics，F(xiàn)itchburg，Mass)：有效光譜范圍0～2 344 cm-1，分辨率為2～3 cm-1，激光器波長785 nm (Innovative Photonic Solution，Monmouth Junction，N.J.)，計算機。

1.2 方法

銀溶膠的制備：按照Lee[12]等的方法將1×10-3mol·L-1硝酸銀溶液加熱至沸騰，使用磁力攪拌器高速攪拌硝酸銀溶液，并逐滴加入濃度為1%檸檬酸鈉溶液，檸檬酸鈉和硝酸銀溶液體積比為1∶40，保持加熱攪拌1 h，反應(yīng)完成后自然冷卻至室溫。上述銀溶膠置于臺式離心機以3 000 r·min-1速度離心30 min，去除上清液獲得濃縮銀溶膠。將制備好的銀溶膠放入4 ℃的冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品的制備：配制20 mg·kg-1的硝基呋喃妥因水溶液，與蜂蜜混合制備含有不同濃度硝基呋喃妥因蜂蜜樣品。制備硝基呋喃妥因濃度范圍為0.4～20 mg·kg-1的蜂蜜樣品共69個，每個樣品利用旋渦混合器將蜂蜜和硝基呋喃妥因水溶液混合均勻，每個濃度梯度的蜂蜜樣品制備3個，其中2個作為校正集樣品，1個作為驗證集樣品。為排除其他環(huán)境因素的干擾，所制備樣品于4 ℃恒溫冰箱中避光保存供后續(xù)采集光譜使用。

光譜采集與預(yù)處理：拉曼光譜系統(tǒng)激光波長為785 nm，設(shè)定激光功率150 mW，積分時間為1 s，用移液槍分別吸取2.5 μL蜂蜜樣品和1 μL銀溶膠，將兩者充分混合后靜置30 s采集光譜。所獲光譜曲線數(shù)據(jù)利用MATLAB R2016b附帶的PLS Toolbox數(shù)據(jù)庫對其進行平滑降噪(Savitsky-Golay，F(xiàn)ilter Width 5，polynomial order 1)和特征峰值提取，并利用Origin 2018進行標(biāo)準曲線的繪制和計算分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜂蜜內(nèi)標(biāo)峰的確認及硝基呋喃妥因拉曼特征峰的歸屬分析

圖1 硝基呋喃妥因標(biāo)準品拉曼光譜(a)和含有硝基呋喃妥因蜂蜜的SERS光譜(b)Fig.1 Raman spectrum of nitrofurantoin standard products (a) and honey SERS spectrum (b) containing nitrofurantoin

為進一步確認739 cm-1拉曼特征位移處的拉曼特征信號，分別采集了含有不同濃度硝基呋喃妥因的蜂蜜樣品的表面增強拉曼光譜。如圖2所示，由于蜂蜜復(fù)雜的成分所造成的熒光背景，即使蜂蜜和納米銀顆粒接觸吸附后，糖類物質(zhì)的多數(shù)拉曼特征信號并沒有得到增強，市售蜂蜜樣品僅在739，1 033和1 399 cm-1處出現(xiàn)了拉曼特征峰。其中，1 399 cm-1拉曼特征位移和硝基呋喃妥因1 353 cm-1處拉曼特征位移非常相近，隨硝基呋喃妥因濃度的增加蜂蜜的1 399 cm-1處特征峰越來越不明顯。另外，1 033 cm-1處蜂蜜和硝基呋喃妥因拉曼特征峰幾乎重疊，隨硝基呋喃妥因濃度增加1 033 cm-1處特征信號強度逐漸遞增，說明不便利用1 025 cm-1處硝基呋喃妥因特征峰強進行定量分析。只有蜂蜜的739 cm-1處拉曼特征峰不受硝基呋喃妥因影響，特征峰比較尖銳清晰。因此選定蜂蜜中739 cm-1處拉曼特征峰強作為內(nèi)標(biāo)，校正蜂蜜中硝基呋喃妥因的特征峰強用于蜂蜜中硝基呋喃妥因定量分析。

圖2 基線扣除后含硝基呋喃妥因蜂蜜表面增強拉曼光譜Fig.2 Surface enhanced Raman spectra of honey containing nitrofurantoin after baseline deduction

2.2 內(nèi)標(biāo)校正效果及穩(wěn)定性分析

表面增強拉曼光譜的信號主要受操作者的操作誤差、儀器波動和光源功率波動影響，儀器波動變化難以預(yù)知，而人為操作難以保證增強劑與蜂蜜樣品混合均勻性與吸附時間的一致性，同一樣品所獲取的拉曼特征峰強重復(fù)性和穩(wěn)定性較差。相同條件下采集30次硝基呋喃妥因濃度為20 mg·kg-1的蜂蜜樣品表面增強拉曼光譜，結(jié)果如圖3(a)所示。1 353和1 612 cm-1處硝基呋喃妥因特征峰強相對標(biāo)準偏差(RSD)分別為11.515 6%和11.162 5%，硝基呋喃妥因拉曼特征峰強波動顯著。利用蜂蜜739 cm-1處拉曼特征位移信號作為內(nèi)標(biāo)，分別計算每個光譜1 353和1 612 cm-1處的硝基呋喃妥因特征峰強與蜂蜜739 cm-1處拉曼特征峰強的比值(I1 353/739，I1 612/739)，結(jié)果顯示采集30次硝基呋喃妥因濃度為20 mg·kg-1的蜂蜜樣品表面增強拉曼光譜的1 353 cm-1處硝基呋喃妥因拉曼特征峰強與739 cm-1處蜂蜜拉曼特征峰強的比值相對標(biāo)準偏差為4.852 6%，1 612 cm-1處的硝基呋喃妥因拉曼特征峰強與蜂蜜739 cm-1處拉曼特征峰強的比值的相對標(biāo)準偏差為4.733 2%，顯著提升了表面增強拉曼特征峰強的重復(fù)性和穩(wěn)定性，校準后的光譜如圖3(b)所示。因為儀器系統(tǒng)誤差及表面增強過程中不可控因素引起的人為誤差等對樣品表面增強光譜中739 cm-1處蜂蜜特征峰強和1 353和1 612 cm-1處硝基呋喃妥因特征峰強的影響是完全相同的，所以通過內(nèi)標(biāo)比值法可以有效消除和減少拉曼信號穩(wěn)定性和重復(fù)性差的問題，可以提升定量分析模型精度。

圖3 30條20 mg·kg-1硝基呋喃妥因蜂蜜的原始光譜(a)和使用739 cm-1處蜂蜜拉曼特征峰校準后的光譜(b)Fig.3 Raw spectra (a) of 20 mg·kg-1 nitrofurantoin honey and spectra (b) calibrated with Raman characteristic peaks at 739 cm-1

分別采集硝基呋喃妥因濃度為1，5，10，15和20 mg·kg-1的蜂蜜樣品表面增強拉曼光譜，每個濃度重復(fù)采集5次，并利用蜂蜜中739 cm-1處拉曼特征峰值強度作為內(nèi)標(biāo)對硝基呋喃妥因拉曼特征峰強度進行了校正。校正前所有樣品在1 353和1 612 cm-1處拉曼特征峰強平均相對標(biāo)準偏差分別為12.418%和7.166%，經(jīng)內(nèi)標(biāo)比值校正后相對標(biāo)準偏差分別降至8.508%和3.808%。1 353 cm-1拉曼特征峰強相比于1 612 cm-1具有較大的相對標(biāo)準偏差，可能是1 353 cm-1處硝基呋喃妥因拉曼特征峰比較接近蜂蜜本身1 399 cm-1處拉曼特征峰，加上受銀溶膠中檸檬酸鹽在1 400 cm-1的拉曼特征峰影響，但結(jié)果表明利用蜂蜜中739 cm-1處拉曼特征峰強校正后兩拉曼特征峰強相對標(biāo)準偏差顯著減小。1 353和1 612 cm-1處硝基呋喃妥因拉曼特征峰強用內(nèi)標(biāo)比值法校正前后與蜂蜜中硝基呋喃妥因濃度的線性關(guān)系如圖4所示。1 353 cm-1處拉曼特征峰強與硝基呋喃妥因濃度的決定系數(shù)R2為0.914，比值校正后決定系數(shù)R2為0.965 3；1 612 cm-1處拉曼特征峰強與硝基呋喃妥因濃度的決定系數(shù)為0.904 2，比值校正后決定系數(shù)為0.962 1。結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)比值校正法可以有效提高硝基呋喃妥因預(yù)測模型精度。

圖4 內(nèi)標(biāo)校準前后硝基呋喃妥因濃度和1 353 cm-1(a)， 1 612 cm-1(b)處拉曼強度的線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship between nitrofurantoin concentration and Raman strength at 1 353 cm-1 (a) and 1 612 cm-1 (b) before and after internal standard calibration

2.3 蜂蜜中硝基呋喃妥因定量預(yù)測模型的建立

制備硝基呋喃妥因濃度范圍為0.4～20 mg·kg-1的蜂蜜樣品69個，分別采集了表面增強拉曼光譜，如圖5(a)所示。采集的每個光譜分別利用蜂蜜739 cm-1處拉曼特征峰強對硝基呋喃妥因1 353和1 612 cm-1處拉曼特征峰強進行了比值校正，結(jié)果如圖5(b)所示。結(jié)果表明，利用蜂蜜中739 cm-1處拉曼特征峰強作為內(nèi)標(biāo)，校正硝基呋喃妥因拉曼特征峰強可以有效減小或消除因儀器波動、激光功率變化以及人為操作等因素差異對硝基呋喃妥因拉曼特征峰強的穩(wěn)定性的影響。

圖5 硝基呋喃妥因蜂蜜表面增強拉曼光譜(a)：校正前；(b)：校正后Fig.5 Surface enhanced Raman spectra of nitrofurantoin honey(a)：Before correction；(b)：After correction

表1 蜂蜜中硝基呋喃妥因定量預(yù)測模型Table 1 Quantitative prediction model of nitrofurantoin in honey

圖6 1 612 cm-1校正前和校正后模型對比(a)：校正集；(b)：驗證集Fig.6 Comparison of validation set models before and after correction of 1 612 cm-1(a)：Calibration set；(b)：Verification set

3 結(jié) 論