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        三種品牌牛奶的熒光光譜特性研究

        2021-02-03 08:03:54殷文志王婷鈺馬超群陳國慶
        光譜學與光譜分析 2021年2期

        殷文志,王婷鈺,朱 拓,馬超群,辜 姣,朱 純,李 磊,陳國慶*

        1.江南大學理學院,江蘇 無錫 214122 2.江南大學物聯(lián)網(wǎng)工程學院,江蘇 無錫 214122 3.江蘇省輕工光電工程技術研究中心,江蘇 無錫 214122

        引 言

        牛奶中富含蛋白質、脂肪、維生素和無機鹽等多種人體需要的營養(yǎng)物質,其中蛋白質是最重要的營養(yǎng)成分之一,牛奶中的蛋白質可以為人體提供20多種氨基酸,其中有8種是人體不能合成的必需氨基酸,且消化率達到90%~100%[1-2]。目前,市場上牛奶的種類很多,質量參差不齊,一些不法商販在牛奶中添加非法添加物或者摻假物,比如2008年的三聚氰胺事件和2011年的黃曲霉毒素M1超標事件[3]。諸多乳品安全事件的發(fā)生,快速準確的檢測牛奶已勢在必行[4-5]。

        目前,國內外牛奶檢測領域存在多種方法,比如:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[6]和膠體金免疫層析法(CGIA)[7]是利用免疫學檢測技術對牛奶進行檢測,具有較高的靈敏度和特異性,但也存在預處理步驟較為繁瑣和成本較高的問題;高效液相色譜法(HPLC)[8]、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)[9]和電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[10]等儀器分析方法具有靈敏度高和精度高的優(yōu)點,比較適合低濃度目標的檢測,但仍存在預處理步驟較多和易受干擾的不足;近紅外光譜法(NIR)[11]和拉曼光譜法(RS)[12]是使用光譜方法對目標進行分析檢測,具有檢測時間短和對目標分子破壞較小等優(yōu)點,然而近紅外光譜的靈敏度較低,拉曼光譜的強度較弱,限制了其應用范圍。

        熒光光譜技術(FS)可以反映目標分子的特性,可對目標分子定性或定量檢測。熒光光譜法具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單和用樣量少等優(yōu)點,被應用于諸多復雜混合物體系的精確檢測。

        本文采用熒光光譜技術,對市場上的三種品牌的不同脂肪含量的純牛奶(超高溫滅菌奶)、鮮奶(巴氏殺菌奶)在不進行預處理的情況下進行測試,研究牛奶的熒光光譜,推斷牛奶的主要熒光物質,并分析全脂牛奶和脫脂牛奶熒光光譜的異同及其原因,為牛奶的成分鑒別和混合物的光譜檢測提供一定的幫助。

        1 實驗部分

        1.1 儀器

        實驗采用英國Edinburg生產(chǎn)的FLS920P型穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜儀。

        1.2 樣品

        實驗所用三個品牌牛奶分別記為A,B和C,牛奶的種類包括:全脂純牛奶、脫脂純牛奶、全脂鮮奶和脫脂鮮奶,共9種。實驗所用酪蛋白(干酪素)為國藥集團化學試劑有限公司提供。

        1.3 方法

        測量9種牛奶樣品和酪蛋白溶液的三維熒光光譜,每次取350 μL牛奶樣品移入石英微量比色皿中,激發(fā)波長范圍為250~450 nm,發(fā)射波長范圍為265~550 nm,激發(fā)波長步長為5 nm,發(fā)射波長步長為1 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設置為5 nm,積分時間為0.1 s。

        測量9種牛奶樣品和酪蛋白溶液的時間分辨熒光光譜,以波長為273.7 nm脈沖光源激發(fā),探測波長為349 nm。

        將全脂純牛奶C以12 000 r·min-1的速度離心15 min,去除上層脂肪后,將下層樣品震蕩5 min,得到離心后的牛奶樣品,測量其熒光發(fā)射光譜。

        使用超純水分別將9種牛奶稀釋至0.1%濃度,測量得到光透過率曲線。

        2 結果與討論

        實驗測得9種牛奶樣品的三維熒光光譜,以品牌C為例,圖1(a)和圖1(b)分別為全脂純牛奶C和脫脂純牛奶C的三維熒光光譜,可以看出牛奶在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生較強的熒光,二者的熒光光譜除熒光強度外基本一致。表1為9種牛奶的熒光光譜特征參數(shù),峰值波長為349 nm左右,最大相差5 nm,半高寬為66 nm左右,最佳激發(fā)波長為291 nm左右,最大相差4 nm,表明9種牛奶的主要熒光物質是相同的。

        表1 牛奶的熒光光譜特征參數(shù)Table 1 Fluorescence spectral characteristic parameters of milk

        圖1 牛奶的三維熒光光譜(a):全脂純牛奶C;(b):脫脂純牛奶CFig.1 Three-dimensional fluorescence spectra of milk(a):Whole milk C;(b):Skim milk C

        牛奶主要由蛋白質、脂肪、碳水化合物和維生素等組成,實驗表明脂肪(在牛奶中主要以脂肪球的形式存在)和碳水化合物沒有熒光,維生素中的維生素B2和維生素B6的熒光峰值波長和最佳激發(fā)波長分別為535和440 nm,395和325 nm。當激發(fā)波長為291 nm時,兩種維生素的熒光較弱。牛奶中酪蛋白占蛋白質的80%左右,在300~400 nm范圍有較強的熒光。

        實驗得到酪蛋白的熒光光譜,酪蛋白的熒光峰值波長為344 nm,半高寬為66 nm,最佳激發(fā)波長為295 nm。激發(fā)波長為291 nm時酪蛋白溶液和9種牛奶的熒光發(fā)射光譜如圖2。

        從圖2看出,酪蛋白與牛奶的熒光光譜除熒光強度外基本一致,且譜形相似。推斷牛奶在291 nm激發(fā)波長下產(chǎn)生熒光的主要熒光物質是酪蛋白。

        圖2 酪蛋白溶液和9種牛奶的熒光發(fā)射光譜(激發(fā)波長為291 nm)Fig.2 Fluorescence emission spectra of casein solution and 9 kinds of milk (excitation wavelength is 291 nm)

        為驗證這一推斷,測得9種牛奶和酪蛋白溶液的時間分辨熒光光譜,如圖3所示,9種牛奶的時間分辨熒光光譜無明顯的差別,平均熒光壽命都為4.6 ns左右,酪蛋白的平均熒光壽命為4.1 ns,熒光壽命擬合參數(shù)如表2所示。

        圖3 9種牛奶和酪蛋白溶液的時間分辨熒光光譜Fig.3 Time resolved fluorescence spectra of 9 kinds of milk and casein solution

        表2 9種牛奶和酪蛋白溶液的熒光壽命擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of fluorescence lifetime of 9 kinds of milk and casein solution with excited

        從時間分辨熒光光譜可以看出牛奶與酪蛋白的熒光壽命基本一致,牛奶的主要熒光物質為酪蛋白,而牛奶的熒光壽命稍大于酪蛋白,這可能是牛奶中其他物質的影響,造成牛奶與酪蛋白的熒光壽命有較小差異。

        酪蛋白是由多種氨基酸以肽鍵組成的高分子化合物,其中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是熒光物質。圖4為色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的分子結構,這些氨基酸的苯環(huán)含有共軛雙鍵,分子被激發(fā)后,會發(fā)生π→π*躍遷,此時分子處于激發(fā)態(tài),但激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定,會通過S1→S0的輻射躍遷發(fā)射熒光。實驗表明色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的熒光峰值波長和最佳激發(fā)波長分別為350和290 nm,300和270 nm,282和258 nm,且它們的相對熒光強度為100∶9∶0.5,所以酪蛋白在激發(fā)波長為291 nm時產(chǎn)生的熒光更多的是來自色氨酸[13]。

        圖4 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的分子結構Fig.4 Molecular structure of tryptophan, tyrosine and phenylalanine

        圖2中9種牛奶樣品在激發(fā)波長為291 nm時的熒光發(fā)射光譜,相同品牌的脫脂牛奶熒光強度高于全脂牛奶。全脂牛奶和脫脂牛奶的區(qū)別主要是脂肪含量,脂肪的存在對牛奶熒光強度有一定的影響。

        為了探究脂肪含量對熒光強度的影響,對全脂純牛奶C進行了離心處理,去除脂肪,圖5是激發(fā)波長為291 nm時全脂純牛奶C、脫脂純牛奶C和離心后的全脂純牛奶C歸一化后的熒光發(fā)射光譜。

        圖5 全脂純牛奶C、脫脂純牛奶C和離心后的全脂純牛奶C歸一化后的熒光發(fā)射光譜(激發(fā)波長為291 nm)Fig.5 The normalized fluorescence emission spectra of whole milk C,skim milk and whole milk C after centrifugation (excitation wavelength is 291 nm)

        圖5中離心后的全脂牛奶熒光強度介于全脂和脫脂之間,脂肪的減少使得牛奶的熒光強度有所增加,而離心處理的牛奶脂肪含量高于脫脂牛奶也使得其熒光強度低于脫脂牛奶。

        測得291 nm激發(fā)下全脂純牛奶C和脫脂純牛奶C的熒光發(fā)射全譜,如圖6,可以看出全脂牛奶的瑞利散射強度明顯高于脫脂牛奶。全脂牛奶的脂肪含量高,散射強,激發(fā)光入射全脂牛奶后更多地被散射,使得其熒光強度低于脫脂牛奶。

        圖6 全脂純牛奶C和脫脂純牛奶C的熒光發(fā)射全譜(激發(fā)波長為291 nm)Fig.6 Full fluorescence emission spectrum of whole milk C and skimmed milk C (excitation wavelength is 291 nm)

        圖7為9種牛奶稀釋后的光透過率曲線,全脂牛奶的透過率都低于脫脂牛奶。入射光通過全脂牛奶時,除了一部分被酪蛋白吸收以外,還有一部分因脂肪的散射而損失,透過率減小,使得全脂牛奶的透過率都低于脫脂牛奶。

        圖7 9種牛奶的光透過率曲線Fig.7 The light transmittance curve of 9 kinds of milk

        實驗研究表明脂肪的存在會導致散射增加,使得全脂牛奶的熒光強度低于同品牌的脫脂牛奶。

        3 結 論

        9種牛奶的三維熒光光譜和時間分辨熒光光譜顯示,牛奶可以在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生熒光,熒光峰值波長為349 nm左右,半高寬為66 nm左右,最佳激發(fā)波長為291 nm左右,平均熒光壽命為4.6 ns左右。實驗表明9種牛奶熒光光譜除熒光強度外基本一致,牛奶的主要熒光物質相同,并通過對比實驗推斷牛奶的主要熒光物質是酪蛋白。全脂牛奶的熒光強度低于同品牌的脫脂牛奶,是由于脂肪的存在會使得散射變強。研究工作可對人們健康飲用不同類型的牛奶有所指導,也可為牛奶這種復雜混合物的分析檢測提供幫助。

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