趙佩佩，劉海溶，楊夢(mèng)，王紅，齊君，劉昌衡，夏雪奎*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250103；2.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)院學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

青霉菌是一類(lèi)常見(jiàn)的真菌，廣泛存在于土壤、植被、空氣、室內(nèi)環(huán)境和各種食品中，對(duì)人類(lèi)生活產(chǎn)生了巨大的影響[1]。青霉菌能夠合成多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中包括聚酮類(lèi)(polyketides)、萜類(lèi)(terpenoids)、生物堿類(lèi)(alkaloids)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(macrolides)等[2-3]。這些代謝產(chǎn)物因具有不同的結(jié)構(gòu)從而有不同的生物活性，尤其是作為抗生素的重要來(lái)源而被廣泛研究，在抗菌、抗氧化和抗腫瘤等方面承擔(dān)不同的角色[4]。來(lái)源于青霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有重大應(yīng)用價(jià)值，可被開(kāi)發(fā)利用為新型藥物。

然而真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成受多因素的影響，其中表觀遺傳修飾起到重要的調(diào)控作用。研究表明，組蛋白賴氨酸殘基的乙酰化常與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，從而促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[5-6]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙?；?HDAC)可對(duì)組蛋白的賴氨酸殘基進(jìn)行修飾，改變其與DNA的親和性，從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)的“開(kāi)放”與“關(guān)閉”狀態(tài)，調(diào)控基因的表達(dá)與沉默[7]。Shwab 等[8]利用HDAC抑制劑處理互隔交鏈孢霉(Alternariaalternata)和擴(kuò)張青霉(Penicilliumexpansum)，可促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。Mao等[9]對(duì)齒梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula)的HDAC基因HdaA進(jìn)行了敲除，發(fā)現(xiàn)約有75%的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因被多效性激活并出現(xiàn)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，HDAC的表達(dá)抑制可促進(jìn)真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成并提高其次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性，甚至挖掘出新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而為新型藥物的研發(fā)儲(chǔ)備先導(dǎo)化合物，并為活性化合物的高效智造提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究以潛在應(yīng)用價(jià)值較高的青霉屬真菌PenicilliumchristenseniaeSD-193.84為研究對(duì)象，對(duì)其HDAC進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，從而改變其次級(jí)代謝產(chǎn)物圖譜，提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。由于化學(xué)表觀遺傳修飾(HDAC抑制劑等)在真菌傳代中很不穩(wěn)定，重復(fù)性較差，因此本研究選擇對(duì)其進(jìn)行分子水平的遺傳操作。首先用生物信息學(xué)方法確定其HDAC同源基因，并以融合PCR[10]的方式構(gòu)建敲除片段，對(duì)HDAC基因進(jìn)行敲除；篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物分析。研究發(fā)現(xiàn)HDAC對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物譜具有顯著影響，是其次級(jí)代謝的全局性調(diào)控因子。本研究為絲狀真菌分子遺傳操作提供參考，并為真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

P.christenseniaeSD-193.84為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株，該菌株對(duì)潮霉素?zé)o抗性。

1.1.2 材料與儀器

真菌基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；PCR高保真酶(南京諾唯贊生物科技有限公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；Yatalase酶(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)；Lysing酶和Driselase酶(Sigma公司)。

PCR基因擴(kuò)增儀960型(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)；DYY-8C型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；安捷倫1260高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的尋找、引物設(shè)計(jì)及敲除片段的構(gòu)建

在NCBI官網(wǎng)(http://www.ncbi,nlm.nih.gov)搜索青霉HDAC基因，下載其序列，以此序列為探針，對(duì)P.christenseniaeSD-193.84基因組進(jìn)行Local BLAST，對(duì)獲得的基因序列利用FGENESH網(wǎng)站(http://www.softberry.com)進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測(cè)，并通過(guò)BLASTP進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)，確定其為HDAC同源基因。在其基因組中找到該基因上下游各3000 bp，設(shè)計(jì)引物，以P.christenseniaeSD-193.84基因組為模板擴(kuò)增上下游片段，與抗性基因(HYG)片段融合，將3個(gè)片段連成用于轉(zhuǎn)化的線性片段。用于構(gòu)建融合片段的引物與一般引物不同，其5′端具有24 bp左右連接片段的重疊接頭。

引物序列如下：

193.84-5-F CCGCCGTGTTGTTGACCT

193.84-5-R-f TCCTTCAATATCATCTTCTGTCGACACGAAAGGGAAGCCACG

193.84-3-F-r ACTTGTTTAGAGGTAATCCTTCTTTCTCTTTGCTGATTCCTG

193.84-3-R ACGCTACCACCAACTGAC

PJ007 TCGACAGAAGATGATATTGAAGGAGCA

PJ008 AAGAAGGATTACCTCTAAACAAGTGTACCT

1.2.2 原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化

將于PDA平板培養(yǎng)3 d的P.christenseniaeSD-193.84孢子用2 mL GMM液體培養(yǎng)基(10 g/L 葡萄糖、50 mL/L Nitrate salts溶液、1 mL/L Trace elements)洗下，離心洗滌兩次(5000 g，5min)，重懸于100 mL GMM培養(yǎng)基，28 ℃ 于搖床培養(yǎng)待孢子萌發(fā)(搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min)；當(dāng)孢子萌發(fā)的芽約為原來(lái)孢子直徑的3倍時(shí)，離心收集孢子；用15 mL OM緩沖液(1.2 mol/L MgSO4于10 mmol/L磷酸鈉緩沖液)洗滌3次，重懸于10 mL原生質(zhì)體制備酶解液(3 mg/mL Lysing、2 mg/mL Yatalase、1 mg/mL Driselase)，于28 ℃ 酶解(80 r/min)；2 h后每30 min取樣鏡檢，當(dāng)萌發(fā)的孢子變圓，大小約為原來(lái)的2倍，停止酶解，置于冰上，加入20 mL預(yù)冷Trapping buffer(0.6 mol/L Sorbitol于0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.0)，離心收集原生質(zhì)體(5000 g，10 min，4 ℃)；去上清后，加入3倍體積的預(yù)冷STC buffer(1.2 mol/L Sorbitol、10 mmol/L CaC12于Tris-HCl, pH 7.5)；加入10 μg敲除片段DNA于原生質(zhì)體中，冰浴60 min；加入600 μL 60%的PEG 4000溶液(600 g/L PEG 4000、50 mmol/L CaCl2于50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)，輕輕混勻，室溫20 min；涂布于SMM 平板(GMM培養(yǎng)基加入1.2 mol/L Sorbitol，20 g/L瓊脂，抗性平板加入150 mg/mL潮霉素)，避光培養(yǎng)3～5 d，待菌落長(zhǎng)出；挑選單個(gè)的轉(zhuǎn)化子于新的抗性PDA平板，傳代3次，性狀穩(wěn)定后進(jìn)行PCR驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

設(shè)計(jì)目的基因的內(nèi)部引物及5′同源臂的上游、3′同源臂的下游引物，以轉(zhuǎn)化子和野生型菌株基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增目的基因內(nèi)部和上下游同源臂及抗性基因片段。挑選無(wú)目的基因條帶而有上下游同源臂和抗性基因的菌株，對(duì)上下游同源臂和抗性基因片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確者為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

引物序列如下：

193.84-F-in GCCATAGCCGTCATTCGT

193.84-R-in CTCGTCATCTCCCTCGTAT

193.84-5-F-out GGCTGTCGGCAAGGTTAT

193.84-3-R-out GTAGGCAAAGTTGGTCTG

Y-HygR-R GGCGAACTTAAGAAGGTATG

Y-HygR-DF AACTCTCAAGCCTACAGGACAC

1.2.4 野生型和敲除株的次級(jí)代謝產(chǎn)物譜分析

將野生型菌株和陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌株分別接種于PDB和大米培養(yǎng)基，培養(yǎng)21 d后，用3倍體積甲醇浸泡提取PDB培養(yǎng)基發(fā)酵物，用3倍體積乙酸乙酯浸泡提取大米培養(yǎng)基發(fā)酵物，室溫連續(xù)萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮獲得浸膏。

稱取浸膏，用色譜甲醇配制20 mg/mL溶液，0.45 μm 濾膜過(guò)濾待用。液相色譜條件：色譜柱為YMC-Pack ODS-A(10 mm × 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為水和甲醇，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)190 ～ 400 nm，柱溫42 ℃，進(jìn)樣量10 μL，洗脫程序：0～60 min，甲醇按體積分?jǐn)?shù)5%～100%進(jìn)行梯度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩端同源臂、中間抗性片段及融合片段擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)

敲除片段及引物位置示意圖見(jiàn)圖1，以野生型菌株DNA為模板，利用高保真DNA聚合酶及相應(yīng)引物擴(kuò)增目的基因的兩端同源臂片段及中間抗性片段，電泳結(jié)果顯示片段大小與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度一致，即1463 bp，1324 bp和2131 bp(圖2(a))。切膠回收后將3個(gè)片段進(jìn)行融合PCR，獲得融合片段產(chǎn)物電泳如圖2(b)，大小為4870 bp(圖2(b))，與預(yù)期長(zhǎng)度一致，切膠回收后轉(zhuǎn)入野生型菌株原生質(zhì)體。

圖1 敲除片段及驗(yàn)證片段示意圖

圖2 兩端同源臂、中間抗性片段、融合片段、轉(zhuǎn)化子和野生型菌株目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

2.2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選

利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化之后，挑取了8個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步驗(yàn)證(圖2(c))，分別對(duì)轉(zhuǎn)化子和野生型中的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)1、2、4轉(zhuǎn)化子中原基因條帶相對(duì)野生型較弱，其中2號(hào)轉(zhuǎn)化子條帶最弱，因此2號(hào)轉(zhuǎn)化子最有可能含有陽(yáng)性菌株。

選擇2號(hào)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分單孢子純化，又挑取了3個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖3)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)轉(zhuǎn)化子中均已無(wú)原基因條帶，并可在轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增到上下游同源臂(2135 bp，1646 bp)及抗性基因片段(2131 bp)，而在野生菌株中，由于上游同源臂的反向引物和下游同源臂的正向引物在抗性片段內(nèi)，故而無(wú)法擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。對(duì)轉(zhuǎn)化子中的3條特有片段進(jìn)行測(cè)序拼接，比對(duì)之后發(fā)現(xiàn)為目的敲除片段序列，因而為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，目的基因敲除成功。

圖3 純化后的轉(zhuǎn)化子及野生型目的基因、同源臂、抗性片段驗(yàn)證結(jié)果圖

2.3 轉(zhuǎn)化子與野生型菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物比較

為了確定HDAC基因敲除后是否影響P.christenseniaeSD-193.84次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，我們比較了野生型和轉(zhuǎn)化子的大米發(fā)酵提取物和PDB發(fā)酵提取物在不同波長(zhǎng)(190～400 nm)下的色譜圖，在320 nm時(shí)，其HPLC色譜圖色譜峰較多且分離度好，因此選擇該波長(zhǎng)用于次級(jí)代謝產(chǎn)物分析，如圖4～5所示。其中轉(zhuǎn)化子的大米發(fā)酵提取物中峰1、3、4和5明顯升高，對(duì)應(yīng)化合物產(chǎn)量提高，而峰2略有下降，可能相應(yīng)化合物產(chǎn)量有所降低。轉(zhuǎn)化子的PDB發(fā)酵提取物中峰3升高，而峰1、2和4有所下降，對(duì)應(yīng)化合物也發(fā)生相應(yīng)產(chǎn)量變化(表1)。而從保留時(shí)間來(lái)看，PDB發(fā)酵提取物中的峰3對(duì)應(yīng)大米發(fā)酵提取物中峰5，該峰在轉(zhuǎn)化子中均為升高趨勢(shì)，也互相印證了彼此結(jié)果。因此可以看出，HDAC基因?qū)τ赑.christenseniaeSD-193.84的次級(jí)代謝具有較大影響，可以通過(guò)HDAC基因的敲除調(diào)控真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，從而為天然產(chǎn)物的獲取提供新途徑。

圖4 大米發(fā)酵提取物在檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm下的HPLC色譜圖

圖5 PDB發(fā)酵提取物在檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm下的HPLC色譜圖

表1 不同培養(yǎng)條件下野生型和轉(zhuǎn)化子發(fā)酵提取物HPLC色譜峰參數(shù)

3 結(jié)論

本文利用融合PCR的方法構(gòu)建了P.christenseniaeSD-193.84的HDAC基因的敲除片段，利用同源重組的方法對(duì)該菌的HDAC基因進(jìn)行了敲除，并利用抗性篩選的方法進(jìn)行了轉(zhuǎn)化子的篩選，PCR結(jié)合測(cè)序的方式對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。為確定HDAC基因?qū).christenseniaeSD-193.84次級(jí)代謝的影響，用不同培養(yǎng)基對(duì)野生型和轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，有機(jī)試劑萃取后對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDAC對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物具有顯著影響，可影響多種化合物的產(chǎn)量變化，從而表明HDAC是青霉次級(jí)代謝中重要的全局調(diào)控因子。本研究不僅為青霉菌生物信息學(xué)分析和分子遺傳操作提供了參考方法，還為真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控研究提供了理論基礎(chǔ)。