曹銘晨，徐龍，辛兆洋，方孟香，邢曉敏，陳蕭，汪川，魏欣欣，任煒*

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266000；2.西海岸新區(qū)第二中醫(yī)院，山東 青島 266400)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種進(jìn)行性的以不可逆氣流受限為特點(diǎn)的慢性炎癥性疾病，其高患病率和病死率成為目前世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1-3]。COPD本質(zhì)是復(fù)雜的慢性炎性過(guò)程，包括氣道中性粒細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激、肺間質(zhì)T細(xì)胞浸潤(rùn)和反復(fù)感染等[1]。目前COPD治療中常用支氣管舒張劑、糖皮質(zhì)激素等，短期內(nèi)可有效緩解癥狀并減少急性加重次數(shù)，但長(zhǎng)期用藥引發(fā)的副作用如耐藥性、多重感染、消化道潰瘍、免疫力低下、骨質(zhì)疏松等問(wèn)題不容忽視[2]。中醫(yī)對(duì)COPD的治療具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為此病屬“喘證”“肺脹”“痰飲”范疇，是由于肺、脾、腎功能失調(diào)導(dǎo)致津液代謝失常、水液停聚于肺部而形成的一種病變，臨床以咳嗽、咳痰、喘息等為主要癥狀[3]。浙貝母-瓜蔞(Fritillariae Thunbergii Bulbus-Trichosanthis Fructus, FTB-TF)配伍是治療肺部疾病常用的藥對(duì)，浙貝母主入肺經(jīng)，具清熱化痰散結(jié)、潤(rùn)肺止咳之功，瓜蔞甘寒而潤(rùn)，善祛痰散結(jié)、清熱滌痰、利氣潤(rùn)燥，與浙貝母相須為用，增強(qiáng)清潤(rùn)化痰而止咳，但是這一藥對(duì)在COPD治療中的分子機(jī)制仍不明確。

中藥復(fù)方具有多成分-多靶點(diǎn)-多通路協(xié)同作用的特點(diǎn),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，整合藥物、生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用生物信息學(xué)手段構(gòu)建藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)模型，從生物網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)水平預(yù)測(cè)分析中藥復(fù)方的可能作用機(jī)制，與中醫(yī)藥整體觀念、組方配伍及中藥多成分-多靶點(diǎn)調(diào)控的特點(diǎn)不謀而合[4]。本文基于中藥分子機(jī)理的生物信息學(xué)分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)在線分析平臺(tái)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探索浙貝母-瓜蔞配伍在COPD治療中的分子作用機(jī)制。

1 研究工具

基于BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[5]獲取浙貝母-瓜蔞的主要成分信息并預(yù)測(cè)可能的相互關(guān)系靶點(diǎn)的基因信息；基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[6]獲取浙貝母-瓜蔞主要成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)；應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選COPD的靶點(diǎn)；應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件[7]構(gòu)建化合物-疾病-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)；基于DAVID(the database for annotation,visualization and integrated discovery)[8]、京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[9]、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[10]、R語(yǔ)言包3.5.1[11]進(jìn)行通路富集分析。

2 研究方法與結(jié)果

2.1 基于BATMAN-TCM預(yù)測(cè)浙貝母-瓜蔞治療COPD的潛在靶點(diǎn)

BATMAN-TCM是一款中藥成分分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具，其預(yù)測(cè)模型基于化學(xué)結(jié)構(gòu)(包括基于FP2指紋圖譜和基于官能團(tuán)的相似度評(píng)分)，副作用，解剖、治療和化學(xué)(anatomical, therapeutic and chemical, ATC)分類系統(tǒng)，藥物誘導(dǎo)相似性來(lái)衡量藥物-相似性基因表達(dá)和化學(xué)-化學(xué)關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)挖掘評(píng)分；基于蛋白質(zhì)序列、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)中的緊密度和基因本體(gene ontology，GO)功能注釋評(píng)分來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相似性；選擇最小冗余最大相關(guān)性(mRMR)特征之后，最終集成ATC-GO, FP2-closeness, STITCH-sequence, expression-closeness, ATC-sequence, functional_group-sequence, functional_group-GO 和side_effect-sequence 8個(gè)特征參數(shù)，采用最大似然比檢驗(yàn)(likelihood ratio test,LR)用作最終預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)，根據(jù)預(yù)測(cè)得分遞減的順序?qū)λ泻蜻x蛋白質(zhì)排名，評(píng)分較高的蛋白質(zhì)視為潛在藥物靶標(biāo)，預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)性能可信度較高[1]。

預(yù)測(cè)相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：

(1)選擇輸入類型：中草藥或中草藥清單；

(2)中草藥或中草藥清單(拼音/拉丁語(yǔ)/英文名，每行一種)：瓜蔞和浙貝母；

(3)輸入預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)的最低限度：20；

(4)Benjamini-Hochberg多元檢測(cè)校正后的P值(調(diào)整后的P值)：0.05。

預(yù)測(cè)得到浙貝母-瓜蔞各活性成分相關(guān)的target name、gene、fit score等參數(shù)，篩選得到BATMAN-TCM相似度評(píng)分大于50的關(guān)鍵靶點(diǎn)共418個(gè)，涉及活性化合物31個(gè)。

GeneCards是一個(gè)整合了125個(gè)包括基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等基因數(shù)據(jù)庫(kù)的綜合性可檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，分別以關(guān)鍵字“chronic obstructive pulmonary diseases”“COPD”篩選COPD相關(guān)的靶點(diǎn)基因信息，剔除相同靶點(diǎn)后得到疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)1878個(gè)，應(yīng)用R語(yǔ)言軟件制作疾病-藥物靶點(diǎn)的VENN圖(圖1)，VENN圖顯示浙貝母-瓜蔞涉及205個(gè)靶點(diǎn)與COPD相關(guān)，占關(guān)鍵靶點(diǎn)數(shù)的49.5%，提示浙貝母-瓜蔞在COPD的治療中可能存在一定的應(yīng)用價(jià)值。浙貝母-瓜蔞的成分中涉及靶點(diǎn)的活性化合物21個(gè)，檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)并列出相關(guān)化合物的藥物學(xué)參數(shù)(表1)。

圖1 浙貝母-瓜蔞和COPD的靶點(diǎn)基因VENN圖

表1 浙貝母-瓜蔞活性成分及其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.2 構(gòu)建浙貝母-瓜蔞治療COPD的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將2.1節(jié)篩選的浙貝母-瓜蔞活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建化合物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。其中節(jié)點(diǎn)(node)代表化合物、基因、蛋白質(zhì)等靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接(edge)代表相互作用，構(gòu)建的化合物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2)共包含435個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中組蛋白脫乙?；?(histone deacetylase 2, HDAC2)、重組人乙醇脫氫酶1C(recombinant human alcohol dehydrogenase 1C, ADH1C)、核糖核酸酶(ribonuclease, RNASE)、鉀電壓門控通道亞家族D成員3(potassium voltage-gated channel subfamily D member 3, KCND3)、鈉通道蛋白9型亞基(sodium channel protein type 9 subunit alpha, SCN9A)等靶點(diǎn)能與大于等于10個(gè)化合物發(fā)生相互作用，證明浙貝母-瓜蔞多成分-多靶點(diǎn)共同作用的特點(diǎn)。

圖2 浙貝母-瓜蔞的化合物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 構(gòu)建浙貝母-瓜蔞關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)基于目前已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)之間直接、間接相互作用信息，通過(guò)計(jì)算得到每個(gè)蛋白相互作用程度的P值，P值高則蛋白質(zhì)相互作用的置信度高。上傳浙貝母-瓜蔞與COPD的共同關(guān)鍵靶點(diǎn)至STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取蛋白相互作用信息，選取P>0.9的最高置信度的蛋白關(guān)系，構(gòu)建浙貝母-瓜蔞治療COPD的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。PPI網(wǎng)絡(luò)包含131個(gè)節(jié)點(diǎn)和236條相互作用關(guān)系(連線)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)分析結(jié)果，其中介數(shù)和度值大于均值(介數(shù)為0.54，度值為3.6)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，包括膜聯(lián)蛋白A1(annexin-A1, ANXA1)、組蛋白脫乙酰基酶1(histone deacetylase 1, HDAC1)、HDAC2、內(nèi)皮素1(endothelin 1, EDN1)、類視黃醇X受體(retinoid X receptor alpha,RXRA)、Alpha-2腎上腺素能受體(alpha-2A adrenergic receptor, ADRA2A)、催產(chǎn)素(oxytocin, OXT)等，其中RXRA能與12個(gè)蛋白發(fā)生相互作用。

圖3 浙貝母-瓜蔞治療COPD的相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集分析

基于DAVID v6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，采用改進(jìn)的Fisher精確檢驗(yàn)算法對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行基因本體GO富集分析，探索浙貝母-瓜蔞的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用，應(yīng)用R軟件繪制GO富集分析結(jié)果條形圖。根據(jù)P值(P<0.005)列出前20條GO途徑(圖4)，分析結(jié)果提示浙貝母-瓜蔞相關(guān)條目主要涉及離子門控通道活性、門控通道活性、底物特異性通道活性、通道活性、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、離子通道活性、陽(yáng)離子通道活性、細(xì)胞外配體門控離子通道活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、配體門控離子通道活性等。

圖4 GO通路富集分析條形圖

2.4 KEGG 通路富集分析

應(yīng)用DAVID v6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行KEGG生物通路富集分析，探索浙貝母-瓜蔞活性成分的靶點(diǎn)蛋白在信號(hào)通路中的作用，相關(guān)靶點(diǎn)基因列表導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，勾選OFFICIAL_GENE_SYMBOL、Gene list、Submit list，選擇基因功能分類工具，修改背景為人類，選擇Pathway，篩選P<0.01的通路確定為可靠通路，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路注釋和分析。利用R語(yǔ)言對(duì)主要代謝通路、生物過(guò)程進(jìn)行繪圖分析。KEGG通道分析主要涉及神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用、cAMP信號(hào)通路、鈣離子信使通路、類膽堿能突觸、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)傳導(dǎo)、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、尼古丁成癮、催產(chǎn)素信號(hào)通路、安非他命成癮、GABA能突觸等途徑，通路富集基因ID見(jiàn)表2，根據(jù)P值(P<0.05)列出前20條通路(圖5)。

圖5 KEGG通路富集分析點(diǎn)狀圖

表2 KEGG通路富集分析靶點(diǎn)基因ID

3 討論

浙貝母-瓜蔞的關(guān)鍵靶點(diǎn)如ANXA1、HDAC與COPD進(jìn)展密切相關(guān)。ANXA1是一類鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白，與糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)以及作為應(yīng)激蛋白參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等有關(guān)，ANXA1在COPD合并肺部細(xì)菌感染中高表達(dá)，且存在病原菌種類和藥物敏差異特點(diǎn)[12]。而HDAC是調(diào)節(jié)COPD患者炎癥因子、氧化應(yīng)激、糖皮質(zhì)激素抵抗的主要蛋白之一，參與調(diào)控COPD患者的肺泡上皮細(xì)胞衰老和慢性炎癥進(jìn)程[13-16]，HDAC2蛋白失活，誘導(dǎo)IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α等炎癥因子表達(dá)[13]。COPD患者肺組織中HDAC2、HDAC5、HDAC8的mRNA水平顯著降低，而重度COPD患者的HDAC2蛋白水平顯著降低，HDAC2表達(dá)與COPD的氣道高反應(yīng)性具有較高相關(guān)度[14]，且與COPD患者肺組織中氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激的發(fā)生有關(guān)[15-16]。因此，HDAC失衡在COPD的炎癥進(jìn)展中非常關(guān)鍵，浙貝母-瓜蔞是否通過(guò)恢復(fù)HDACs活性，使其發(fā)生去乙?；钄嘌装Y基因轉(zhuǎn)錄、抗氧化應(yīng)激及減輕糖皮質(zhì)激素抵抗，從而控制COPD發(fā)展值得進(jìn)一步深入研究。

分析顯示浙貝母-瓜蔞的分子途徑主要涉及離子門控通道活性、底物特異性通道活性、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、離子通道活性、細(xì)胞外配體門控離子通道活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等，推測(cè)可能通過(guò)影響不同類型通道活性而產(chǎn)生相應(yīng)藥理作用。而KEGG富集分析中相關(guān)度最高的途徑為神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用，其中包括類膽堿能、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)可能在浙貝母-瓜蔞調(diào)控COPD中發(fā)揮重要作用，即浙貝母-瓜蔞可能通過(guò)調(diào)控某些通道的活性，影響類膽堿能、5-羥色胺、多巴胺等多種神經(jīng)活動(dòng)配體-受體的相互作用而實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)調(diào)控COPD的進(jìn)展，證明了中藥復(fù)方多成分-多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。多巴胺是一種中樞神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)、內(nèi)分泌等多種生理功能，還可能存在抗炎作用[17]，研究顯示多巴胺受體激動(dòng)劑可用于治療COPD的咳嗽和咳痰等癥狀[18]；在COPD合并心力衰竭治療中，多巴胺可選擇性興奮心臟β-受體，改善膈肌、腦和冠狀動(dòng)脈供血[19]。COPD患者呼吸道阻塞最重要的可逆機(jī)制是膽堿能引起呼吸道收縮，肺部膽堿能神經(jīng)分布于血管、腺體、支氣管平滑肌和呼吸性細(xì)支氣管。膽堿能受體分為M受體和N受體，肺組織中主要存在M1、M2、M3等3種M受體亞型。COPD患者呼吸道和肺組織中M受體的數(shù)量或功能異常，M受體數(shù)量減少，M2受體比例降低，M1、M3受體比例增加[20]。5-HT與呼吸系統(tǒng)疾病密切關(guān)聯(lián)，生理狀態(tài)下5-HT主要儲(chǔ)藏于血小板致密體中，當(dāng)血小板受到炎癥、低氧等因素刺激釋放大量5-HT并與轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合，引起肺血管收縮及血管平滑肌細(xì)胞增殖等病理反應(yīng)[21]，COPD狀態(tài)下5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)明顯增高，5-HT大量釋放進(jìn)一步促進(jìn)COPD加重[22]。此外，KEGG富集分析提示浙貝母-瓜蔞可能同時(shí)影響多巴胺和Ca2+信使通路，提示其在COPD心肺功能不全治療上可能具有一定價(jià)值?，F(xiàn)代臨床治療COPD心肺功能不全多應(yīng)用硝苯地平和多巴胺，硝苯地平是一種較強(qiáng)的Ca2+通道阻滯劑，通過(guò)抑制Ca2+內(nèi)流促進(jìn)擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和增加血流量、松弛血管平滑肌，降低舒張期細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷而增強(qiáng)心肌舒縮活動(dòng)協(xié)調(diào)性，改善主動(dòng)脈舒縮功能，降低心率，改善患者氣道通氣功能[23-25]。因此，浙貝母-瓜蔞是否同時(shí)作用于兩條通路而改善COPD心肺功能不全仍值得進(jìn)一步探索。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法從分子作用機(jī)制方面深入挖掘了浙貝母-瓜蔞配伍治療COPD可能的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，揭示了浙貝母-瓜蔞多成分-多靶點(diǎn)-多通路調(diào)控COPD進(jìn)展的作用特點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)浙貝母-瓜蔞與COPD靶點(diǎn)相關(guān)的活性化合物包括較多揮發(fā)油類成分及其常含有的小分子醇、醛及酸類化合等，推測(cè)浙貝母-瓜蔞的揮發(fā)油部分可能是治療COPD的關(guān)鍵活性部位。COPD存在不同程度的肺氣阻塞、通氣障礙，根據(jù)中醫(yī)學(xué)“滯則通之”的治療原則可以應(yīng)用具有芳香行氣、理氣通關(guān)、化濕醒脾等藥理作用的芳香類中藥，而揮發(fā)油成分是芳香中藥的主要藥理活性部位，浙貝母、瓜蔞雖不屬于芳香類藥物，但揮發(fā)油部位可能具有相似的藥理作用。目前關(guān)于浙貝母-瓜蔞配伍前后揮發(fā)油部位化學(xué)成分及藥理活性的研究較少，值得深入研究。此外，分子對(duì)接及PPI網(wǎng)絡(luò)提示的關(guān)鍵靶點(diǎn)如ANXA1、HDAC2，其中ANXA1是Campesterol(浙貝母/瓜蔞)、Bryonolic Acid(瓜蔞)、Cucurbitacin C(瓜蔞)3種化合物的共同靶點(diǎn)，而HDAC2是Palmitone(浙貝母/瓜蔞)、N-Nonanol(瓜蔞)、Lauric Aldehyde(瓜蔞)3種化合物的共同靶點(diǎn)，提示該藥對(duì)協(xié)同治療COPD的作用特點(diǎn)，且以瓜蔞的活性成分為主，這與中藥理論中瓜蔞作為君藥以“開(kāi)胸散結(jié)”的功效治療COPD的理念不謀而合，后續(xù)可以從兩者配伍后關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)變化情況及相關(guān)活性成分的篩選方面開(kāi)展進(jìn)一步研究。生物通路方面主要涉及類膽堿能、5-羥色胺、多巴胺等多種神經(jīng)活動(dòng)配體-受體的相互作用等，也為深入研究浙貝母-瓜蔞的整體性作用機(jī)制提供參考和新的研究方向。