費 龍，馬浩然*，毛曉麗，文 煜(.武漢市第一醫(yī)院藥學部，武漢 4300；.武漢音樂學院醫(yī)療中心，武漢 430000)

糖尿病心肌病是糖尿病的一種主要慢性并發(fā)癥，心肌纖維化是其主要病理特征，心肌成纖維細胞的大量增殖、基質蛋白及膠原蛋白的大量沉積是導致心肌纖維化和糖尿病心力衰竭的主要原因[1-2]。糖尿病心肌病的發(fā)病機制復雜、代謝紊亂、心肌纖維化和心臟自主神經(jīng)病變等均是其可能的影響因素[3]。胰高血糖素樣肽(GLP-1)是有末端空腸、回腸及結腸L細胞分泌的一類多肽，通過與其受體結合具有顯著的降血糖功效，但其半衰期過短，僅為2 min[4]。利拉魯肽作為一種GLP-1類似物，其半衰期較長，可促進GLP-1受體胰高血糖素樣肽1受體(GLP-1R)的表達升高[5]，對糖尿病心肌損傷具有保護作用[6]。本研究采取高糖高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合注射鏈脲霉素(STZ)構建糖尿病模型，并用不同劑量的利拉魯肽進行干預，研究利拉魯肽保護糖尿病心肌損傷的可能機制，以期為臨床預防及延緩糖尿病心肌病提供新思路。

1 儀器與材料

1.1儀器 ACCU-CHEK型快速血糖測定儀(羅氏公司)；Image Master VDS型凝膠自動成像儀(瑞典Pharmacia公司)；BX 51型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；H-7500型透射電鏡(日本Hitachi公司)。

1.2試藥 利拉魯肽( 規(guī)格：3 mL∶18 mg，批號P63001)，丹麥諾和諾德公司；鏈脲霉素(STZ，批號2101605)、甲醛和戊二醛，均購于美國Sigma-Aldrich公司；枸櫞酸鉀緩沖液，湖北百奧斯生物科技有限公司；水合氯醛，上海雅吉生物科技有限公司；醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛，德國默克公司；高糖高脂飼料，遼寧長生生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(批號分別為20170309，20170413，20170316)，賽默飛世爾科技有限公司；Ⅰ型膠原蛋白(Col-1)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)的引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；兔抗鼠模型微管相關蛋白1輕鏈3(LC3B)、克隆人微管相關蛋白1輕鏈3-β-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、克隆人微管相關蛋白1輕鏈3-β-Ⅱ(LC3-Ⅱ)，選擇性自噬接頭蛋白(p62)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，磷酸化AMPK(P-AMPK)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(P-mTOR)和GAPDH抗體，美國Abcam公司。

1.3動物 清潔級雄性SD成年大鼠40只，體質量為200～260 g，購于中國食品藥品檢定研究院[許可證號：SCXK(京)2014-0013]，培育室溫度為20～25 ℃，濕度保持在65%～70%，人工光照(每12 h晝夜交替1次)，自由飲水，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

2 方法

2.1實驗動物分組及模型的制備 將40只SD大鼠隨機分為正常組(10只)和造模組(30只)。適用性飼養(yǎng)5 d后，造模組給予高糖高脂飼料，正常組常規(guī)飼養(yǎng)。8周后，造模組禁食不禁水，一次性腹腔注射STZ 30 mg·kg-1，正常組給予等量枸櫞酸鉀緩沖液。注射72 h后尾靜脈采血用ACCU-CHEK快速血糖測定儀測定隨機血糖，血糖含量≥16.7 mmol·L-1判定為造模成功[7]。造模后繼續(xù)高糖高脂飼料飼養(yǎng)6周(飼養(yǎng)過程中死亡3只)，最終納入27只糖尿病模型大鼠，隨機分為模型組和利拉魯肽高、低劑量組，各9只，利拉魯肽高、低劑量組大鼠分別于早晚7點腹腔注射利拉魯肽200,50 μg·kg-1，正常組和模型組注射等量生理鹽水，共干預8周。

2.2樣本采集及處理 末次給藥24 h后，用10 g·L-1水合氯醛麻醉大鼠后取血，用于生化及血脂指標檢測，取血完成后斷頭處死大鼠，于冰上打開胸腔，迅速取出心臟，用4 ℃生理鹽水沖洗干凈，清除心臟外組織后稱定心臟質量，計算心肌肥厚指數(shù)(HWI=心臟質量÷體質量)；取部分左心室組織，部分用40 g·L-1的甲醛固定，進行常規(guī)脫水、包埋、切片后用于心肌組織病理學檢測；剩余組織用40 g·L-1的戊二醛固定，進行常規(guī)脫水、包埋后制備超薄切片用于電鏡觀察；另取部分心肌組織，放入消毒滅菌過的RNase Free研缽中加入液氮研磨成粉末，保存于RNase Free的離心管中，液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱用于qRT-PCR和Western Blot檢測。

2.3光鏡下觀察大鼠心肌組織病理學形態(tài) 取2.2項下制備好的切片，常規(guī)脫蠟脫水后，進行HE染色，利用Olympus光學顯微鏡觀察心肌組織形態(tài)結構。

2.4電鏡下觀察心肌組織中自噬小體超微形態(tài)觀察 取2.2項下制備的切片，用PBS浸洗2～3次，進行梯度乙醇脫水處理，用超薄切片機切成1 μm的薄片進行觀察定位后，繼續(xù)切取75 nm的超薄切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在H-7500型透射電鏡下觀察并拍照記錄，采用Image Pro Plus 6.0軟件進行自噬小體超微形態(tài)觀察及計數(shù)。

2.5免疫組化檢測心肌組織中LC3B蛋白的表達水平 采用免疫組化處理2.2項下制備好的切片，置于光鏡下觀察。采用Image Pro Plus 6.0軟件對各組織400倍下的3張照片進行積分光密度(IOD)分析，計算平均光密度值(AOD)。

2.6qRT-PCR法檢測心肌組織中Col-1和TGF-β1的mRNA表達水平 按照總RNA提取試劑盒說明書上的操作步驟提取各組大鼠心肌組織中的總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。PCR反應參數(shù)設置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反應進行40個循環(huán)。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。各孔設置3個復孔。用2-△△Ct法計算mRNA的表達量。引物信息：Col-1(上游引物：5′-TTCACCTACAGCACGCTTGT-3′；下游引物：5′-TTGGGATGGAGGGAGTTTAC-3′，長度196 bp)；TGF-β1(上游引物：5′-ACCAGTTCCCAGAGGTGTATGT-3′；下游引物：5′-TTGGGACAGAAGTGCTTGACTTC-3′，長度244 bp);GAPDH(上游引物：5′-GATGGGTGTGAACCACGAGAAA-3′；下游引物：5′-ACGGATACATTGGGGGTAGGAA-3′，長度330 bp)。

2.7Western Blot法檢測心肌組織中LC-3Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR的蛋白表達水平 取心肌組織上清液，采用Bradford調整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至甲醛預處理過的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗鼠LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR和GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標記的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL發(fā)光液將PVD膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標蛋白與內參積分吸光度值的比值表示蛋白表達水平。

3 結果

3.1利拉魯肽對糖尿病大鼠HWI及生化指標的影響 見表1。由表1可知，與正常組相比，模型組大鼠的HWI、FPG、FINS、TC和TG水平均顯著升高，而利拉魯肽干預后上述指標均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠HWI及生化指標比較

3.2利拉魯肽對糖尿病大鼠心肌組織損傷的影響 見圖1。由圖1可知，正常組大鼠心肌細胞排列整齊，心肌間質少，細胞核大小及胞漿染色均勻；模型組大鼠心肌細胞腫脹，細胞分布散亂，排列紊亂，且間質明顯增多，胞漿染色較淺，部分細胞核顯著增大；利拉魯肽高、低劑量組心肌細胞腫脹及結構散亂情況明顯減輕，染色較為均勻，且利拉魯肽高劑量組干預效果更佳。

3.3利拉魯肽對糖尿病大鼠心肌組織中自噬小體數(shù)量及LC3B蛋白表達的影響 見圖2、圖3和表2。由圖2和表2可知，與正常組相比，模型組小鼠心肌組織中自噬小體數(shù)量顯著降低，利拉魯肽高、低劑量組自噬小體數(shù)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；由圖3和表2可知，與正常組相比，模型組小鼠心肌組織中LC3B蛋白的AOD顯著降低，利拉魯肽高、低劑量組AOD水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結果(×400)

圖2 各組大鼠心肌組織透射電鏡觀察結果(×10 000)

圖3 各組大鼠心肌組織LC3B免疫組化結果(×400)

表2 各組大鼠心肌組織中自噬小體數(shù)量及LC3B蛋白表達比較

3.4利拉魯肽對糖尿病大鼠心肌組織中Col-1和TGF-β1的mRNA表達水平的影響 見表3。由表3可知，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中Col-1和TGF-β1的mRNA表達水平均顯著升高，利拉魯肽高、低劑量組Col-1和TGF-β1的mRNA表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌組織中Col-1和TGF-β1的mRNA表達水平

3.5利拉魯肽對糖尿病大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR蛋白表達的影響 見圖4和表4。由圖4和表4可知，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平均顯著降低，p62和mTOR磷酸化水平均顯著升高，利拉魯肽干預后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平顯著升高，p62和mTOR磷酸化水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR蛋白表達比較

圖4 各組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR蛋白表達圖譜

4 討論

本研究通過采用高糖高脂飼料聯(lián)合STZ腹腔注射的方法構建了糖尿病大鼠模型[8]，研究發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠相比，模型組大鼠HWI顯著升高，而體質量顯著降低，表明糖尿病模型建立成功。糖尿病心肌病作為一種慢性且不可逆轉的心臟并發(fā)癥，心肌間質纖維化是其特征性病理表現(xiàn)，可引起左心室舒張及收縮功能障礙，最終發(fā)展為心力衰竭[9-10]。本研究通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌組織結構排列紊亂，有局灶性壞死情況發(fā)生，且心肌細胞間質中成纖維細胞明顯增多，細胞間隙也顯著增大，而透射電鏡下可發(fā)現(xiàn)自噬小體數(shù)量顯著減少，免疫組化結果顯示，自噬標志性蛋白LC3B的蛋白表達顯著降低，而利拉魯肽干預后，能夠有效改善心肌纖維化程度，并增加自噬小體數(shù)量及LC3B蛋白表達水平，表明利拉魯肽具有保護糖尿病心肌損傷的作用，可能是通過調控自噬過程來完成的。

TGF-β1是促成纖維化的關鍵因子，其通過激活TGF-β1/Smad信號轉導途徑，誘導膠原合成[11-12]。Col-1作為信號轉導途徑的下游信號因子，被激活后能夠調控細胞外基質的合成并抑制其降解，從而引起心肌組織處的細胞外基質過度沉積，而心肌纖維化與細胞外基質過度沉積關系密切[13]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠心肌組織中Col-1、TGF-β1的mRNA表達水平顯著升高，而經(jīng)過利拉魯肽干預后，Col-1和TGF-β1的mRNA表達水平降低，表明利拉魯肽可能是通過抑制促纖維化因子的表達而發(fā)揮抗心肌纖維化作用的。Dalsgaard N B等[14]研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽作為GLP-1的類似物，通過促進GLP-1R合成，并與之結合，能夠與心、腦血管上的多個靶點相互作用，減少心肌細胞凋亡、抗心肌纖維化及保護內皮功能，與本研究結果類似。

自噬是一種高度保守的細胞行為，在細胞生長發(fā)育、成熟分化和細胞免疫等方面均發(fā)揮著重要作用，被稱為Ⅱ型程序性死亡[15]。自噬通過清除和降解自身受損細胞器及大分子物質，形成一種循環(huán)再利用系統(tǒng)，通過其降解產(chǎn)物提供細胞能量、重建細胞結構，實現(xiàn)自身代謝需要，維持細胞穩(wěn)態(tài)功能[16]。AMPK是感知細胞能量狀態(tài)的重要激酶，其在細胞生長、自噬和凋亡過程中均發(fā)揮著重要作用[17]，活化的AMPK能夠磷酸化下游效應因子mTOR從而抑制細胞自噬[18]，人微管相關蛋白1輕鏈3-β(LC3)和p62是細胞自噬過程的2個標志性蛋白，當細胞發(fā)生自噬時，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)信號途徑會激活mTOR，促進LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ，同時還會泛素化p62激活細胞的選擇自噬性降解[19-20]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平顯著降低，p62和mTOR磷酸化水平均顯著升高，表明糖尿病引起的代謝紊亂能夠通過抑制AMPK激活從而降低機體自噬水平，進而加重心肌損傷，而利拉魯肽干預后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平顯著升高，p62和mTOR磷酸化水平顯著降低，表明利拉魯肽可能是通過激活AMPK，抑制mTOR信號轉導途徑，促進心肌組織的自噬過程，減輕心肌纖維化，進而減輕心肌損傷。

綜上所述，利拉魯肽作為一種GLP-1類似物，除了可以調節(jié)糖脂代謝外，還可發(fā)揮抗糖尿病心肌病的保護作用，其作用機制可能是通過下調促纖維化細胞因子減少Col-1合成，同時促進AMPK蛋白磷酸化，抑制mTOR磷酸化來增強細胞自噬從而改善糖尿病心肌組織纖維化病變。