費(fèi) 龍，馬浩然*，毛曉麗，文 煜(.武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 4300；.武漢音樂學(xué)院醫(yī)療中心，武漢 430000)

糖尿病心肌病是糖尿病的一種主要慢性并發(fā)癥，心肌纖維化是其主要病理特征，心肌成纖維細(xì)胞的大量增殖、基質(zhì)蛋白及膠原蛋白的大量沉積是導(dǎo)致心肌纖維化和糖尿病心力衰竭的主要原因[1-2]。糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、代謝紊亂、心肌纖維化和心臟自主神經(jīng)病變等均是其可能的影響因素[3]。胰高血糖素樣肽(GLP-1)是有末端空腸、回腸及結(jié)腸L細(xì)胞分泌的一類多肽，通過(guò)與其受體結(jié)合具有顯著的降血糖功效，但其半衰期過(guò)短，僅為2 min[4]。利拉魯肽作為一種GLP-1類似物，其半衰期較長(zhǎng)，可促進(jìn)GLP-1受體胰高血糖素樣肽1受體(GLP-1R)的表達(dá)升高[5]，對(duì)糖尿病心肌損傷具有保護(hù)作用[6]。本研究采取高糖高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合注射鏈脲霉素(STZ)構(gòu)建糖尿病模型，并用不同劑量的利拉魯肽進(jìn)行干預(yù)，研究利拉魯肽保護(hù)糖尿病心肌損傷的可能機(jī)制，以期為臨床預(yù)防及延緩糖尿病心肌病提供新思路。

1 儀器與材料

1.1儀器 ACCU-CHEK型快速血糖測(cè)定儀(羅氏公司)；Image Master VDS型凝膠自動(dòng)成像儀(瑞典Pharmacia公司)；BX 51型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；H-7500型透射電鏡(日本Hitachi公司)。

1.2試藥 利拉魯肽( 規(guī)格：3 mL∶18 mg，批號(hào)P63001)，丹麥諾和諾德公司；鏈脲霉素(STZ，批號(hào)2101605)、甲醛和戊二醛，均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；枸櫞酸鉀緩沖液，湖北百奧斯生物科技有限公司；水合氯醛，上海雅吉生物科技有限公司；醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛，德國(guó)默克公司；高糖高脂飼料，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(批號(hào)分別為20170309，20170413，20170316)，賽默飛世爾科技有限公司；Ⅰ型膠原蛋白(Col-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；兔抗鼠模型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3B)、克隆人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、克隆人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β-Ⅱ(LC3-Ⅱ)，選擇性自噬接頭蛋白(p62)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，磷酸化AMPK(P-AMPK)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(P-mTOR)和GAPDH抗體，美國(guó)Abcam公司。

1.3動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD成年大鼠40只，體質(zhì)量為200～260 g，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院[許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0013]，培育室溫度為20～25 ℃，濕度保持在65%～70%，人工光照(每12 h晝夜交替1次)，自由飲水，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的制備 將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)和造模組(30只)。適用性飼養(yǎng)5 d后，造模組給予高糖高脂飼料，正常組常規(guī)飼養(yǎng)。8周后，造模組禁食不禁水，一次性腹腔注射STZ 30 mg·kg-1，正常組給予等量枸櫞酸鉀緩沖液。注射72 h后尾靜脈采血用ACCU-CHEK快速血糖測(cè)定儀測(cè)定隨機(jī)血糖，血糖含量≥16.7 mmol·L-1判定為造模成功[7]。造模后繼續(xù)高糖高脂飼料飼養(yǎng)6周(飼養(yǎng)過(guò)程中死亡3只)，最終納入27只糖尿病模型大鼠，隨機(jī)分為模型組和利拉魯肽高、低劑量組，各9只，利拉魯肽高、低劑量組大鼠分別于早晚7點(diǎn)腹腔注射利拉魯肽200,50 μg·kg-1，正常組和模型組注射等量生理鹽水，共干預(yù)8周。

2.2樣本采集及處理 末次給藥24 h后，用10 g·L-1水合氯醛麻醉大鼠后取血，用于生化及血脂指標(biāo)檢測(cè)，取血完成后斷頭處死大鼠，于冰上打開胸腔，迅速取出心臟，用4 ℃生理鹽水沖洗干凈，清除心臟外組織后稱定心臟質(zhì)量，計(jì)算心肌肥厚指數(shù)(HWI=心臟質(zhì)量÷體質(zhì)量)；取部分左心室組織，部分用40 g·L-1的甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片后用于心肌組織病理學(xué)檢測(cè)；剩余組織用40 g·L-1的戊二醛固定，進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋后制備超薄切片用于電鏡觀察；另取部分心肌組織，放入消毒滅菌過(guò)的RNase Free研缽中加入液氮研磨成粉末，保存于RNase Free的離心管中，液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱用于qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)。

2.3光鏡下觀察大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài) 取2.2項(xiàng)下制備好的切片，常規(guī)脫蠟脫水后，進(jìn)行HE染色，利用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.4電鏡下觀察心肌組織中自噬小體超微形態(tài)觀察 取2.2項(xiàng)下制備的切片，用PBS浸洗2～3次，進(jìn)行梯度乙醇脫水處理，用超薄切片機(jī)切成1 μm的薄片進(jìn)行觀察定位后，繼續(xù)切取75 nm的超薄切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在H-7500型透射電鏡下觀察并拍照記錄，采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行自噬小體超微形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)。

2.5免疫組化檢測(cè)心肌組織中LC3B蛋白的表達(dá)水平 采用免疫組化處理2.2項(xiàng)下制備好的切片，置于光鏡下觀察。采用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)各組織400倍下的3張照片進(jìn)行積分光密度(IOD)分析，計(jì)算平均光密度值(AOD)。

2.6qRT-PCR法檢測(cè)心肌組織中Col-1和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平 按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書上的操作步驟提取各組大鼠心肌組織中的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA的合成。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。各孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的表達(dá)量。引物信息：Col-1(上游引物：5′-TTCACCTACAGCACGCTTGT-3′；下游引物：5′-TTGGGATGGAGGGAGTTTAC-3′，長(zhǎng)度196 bp)；TGF-β1(上游引物：5′-ACCAGTTCCCAGAGGTGTATGT-3′；下游引物：5′-TTGGGACAGAAGTGCTTGACTTC-3′，長(zhǎng)度244 bp);GAPDH(上游引物：5′-GATGGGTGTGAACCACGAGAAA-3′；下游引物：5′-ACGGATACATTGGGGGTAGGAA-3′，長(zhǎng)度330 bp)。

2.7Western Blot法檢測(cè)心肌組織中LC-3Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR的蛋白表達(dá)水平 取心肌組織上清液，采用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過(guò)的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗鼠LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR和GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL發(fā)光液將PVD膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參積分吸光度值的比值表示蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠HWI及生化指標(biāo)的影響 見表1。由表1可知，與正常組相比，模型組大鼠的HWI、FPG、FINS、TC和TG水平均顯著升高，而利拉魯肽干預(yù)后上述指標(biāo)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠HWI及生化指標(biāo)比較

3.2利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠心肌組織損傷的影響 見圖1。由圖1可知，正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，心肌間質(zhì)少，細(xì)胞核大小及胞漿染色均勻；模型組大鼠心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞分布散亂，排列紊亂，且間質(zhì)明顯增多，胞漿染色較淺，部分細(xì)胞核顯著增大；利拉魯肽高、低劑量組心肌細(xì)胞腫脹及結(jié)構(gòu)散亂情況明顯減輕，染色較為均勻，且利拉魯肽高劑量組干預(yù)效果更佳。

3.3利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠心肌組織中自噬小體數(shù)量及LC3B蛋白表達(dá)的影響 見圖2、圖3和表2。由圖2和表2可知，與正常組相比，模型組小鼠心肌組織中自噬小體數(shù)量顯著降低，利拉魯肽高、低劑量組自噬小體數(shù)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；由圖3和表2可知，與正常組相比，模型組小鼠心肌組織中LC3B蛋白的AOD顯著降低，利拉魯肽高、低劑量組AOD水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(×400)

圖2 各組大鼠心肌組織透射電鏡觀察結(jié)果(×10 000)

圖3 各組大鼠心肌組織LC3B免疫組化結(jié)果(×400)

表2 各組大鼠心肌組織中自噬小體數(shù)量及LC3B蛋白表達(dá)比較

3.4利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠心肌組織中Col-1和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平的影響 見表3。由表3可知，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中Col-1和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，利拉魯肽高、低劑量組Col-1和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌組織中Col-1和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平

3.5利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR蛋白表達(dá)的影響 見圖4和表4。由圖4和表4可知，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平均顯著降低，p62和mTOR磷酸化水平均顯著升高，利拉魯肽干預(yù)后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平顯著升高，p62和mTOR磷酸化水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR蛋白表達(dá)比較

圖4 各組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR蛋白表達(dá)圖譜

4 討論

本研究通過(guò)采用高糖高脂飼料聯(lián)合STZ腹腔注射的方法構(gòu)建了糖尿病大鼠模型[8]，研究發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠相比，模型組大鼠HWI顯著升高，而體質(zhì)量顯著降低，表明糖尿病模型建立成功。糖尿病心肌病作為一種慢性且不可逆轉(zhuǎn)的心臟并發(fā)癥，心肌間質(zhì)纖維化是其特征性病理表現(xiàn)，可引起左心室舒張及收縮功能障礙，最終發(fā)展為心力衰竭[9-10]。本研究通過(guò)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，有局灶性壞死情況發(fā)生，且心肌細(xì)胞間質(zhì)中成纖維細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞間隙也顯著增大，而透射電鏡下可發(fā)現(xiàn)自噬小體數(shù)量顯著減少，免疫組化結(jié)果顯示，自噬標(biāo)志性蛋白LC3B的蛋白表達(dá)顯著降低，而利拉魯肽干預(yù)后，能夠有效改善心肌纖維化程度，并增加自噬小體數(shù)量及LC3B蛋白表達(dá)水平，表明利拉魯肽具有保護(hù)糖尿病心肌損傷的作用，可能是通過(guò)調(diào)控自噬過(guò)程來(lái)完成的。

TGF-β1是促成纖維化的關(guān)鍵因子，其通過(guò)激活TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)膠原合成[11-12]。Col-1作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游信號(hào)因子，被激活后能夠調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的合成并抑制其降解，從而引起心肌組織處的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，而心肌纖維化與細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積關(guān)系密切[13]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心肌組織中Col-1、TGF-β1的mRNA表達(dá)水平顯著升高，而經(jīng)過(guò)利拉魯肽干預(yù)后，Col-1和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平降低，表明利拉魯肽可能是通過(guò)抑制促纖維化因子的表達(dá)而發(fā)揮抗心肌纖維化作用的。Dalsgaard N B等[14]研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽作為GLP-1的類似物，通過(guò)促進(jìn)GLP-1R合成，并與之結(jié)合，能夠與心、腦血管上的多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，減少心肌細(xì)胞凋亡、抗心肌纖維化及保護(hù)內(nèi)皮功能，與本研究結(jié)果類似。

自噬是一種高度保守的細(xì)胞行為，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、成熟分化和細(xì)胞免疫等方面均發(fā)揮著重要作用，被稱為Ⅱ型程序性死亡[15]。自噬通過(guò)清除和降解自身受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì)，形成一種循環(huán)再利用系統(tǒng)，通過(guò)其降解產(chǎn)物提供細(xì)胞能量、重建細(xì)胞結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)自身代謝需要，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能[16]。AMPK是感知細(xì)胞能量狀態(tài)的重要激酶，其在細(xì)胞生長(zhǎng)、自噬和凋亡過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用[17]，活化的AMPK能夠磷酸化下游效應(yīng)因子mTOR從而抑制細(xì)胞自噬[18]，人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β(LC3)和p62是細(xì)胞自噬過(guò)程的2個(gè)標(biāo)志性蛋白，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)信號(hào)途徑會(huì)激活mTOR，促進(jìn)LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，同時(shí)還會(huì)泛素化p62激活細(xì)胞的選擇自噬性降解[19-20]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平顯著降低，p62和mTOR磷酸化水平均顯著升高，表明糖尿病引起的代謝紊亂能夠通過(guò)抑制AMPK激活從而降低機(jī)體自噬水平，進(jìn)而加重心肌損傷，而利拉魯肽干預(yù)后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平顯著升高，p62和mTOR磷酸化水平顯著降低，表明利拉魯肽可能是通過(guò)激活A(yù)MPK，抑制mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)心肌組織的自噬過(guò)程，減輕心肌纖維化，進(jìn)而減輕心肌損傷。

綜上所述，利拉魯肽作為一種GLP-1類似物，除了可以調(diào)節(jié)糖脂代謝外，還可發(fā)揮抗糖尿病心肌病的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)促纖維化細(xì)胞因子減少Col-1合成，同時(shí)促進(jìn)AMPK蛋白磷酸化，抑制mTOR磷酸化來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞自噬從而改善糖尿病心肌組織纖維化病變。