翟英英，位恒超(.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450008；.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450000)

中藥及其制劑是經(jīng)數(shù)千年傳承與發(fā)展的產(chǎn)物，其臨床療效已得到了廣大醫(yī)患的認(rèn)可。春血安膠囊是由熟地黃、鹽車前子、肉桂、澤瀉和柴胡等13味中藥制成的中成藥復(fù)方制劑，主治肝腎不足、沖任失調(diào)所致的月經(jīng)失調(diào)、崩漏和痛經(jīng)，癥見(jiàn)經(jīng)行錯(cuò)后、經(jīng)量多或淋漓不凈、經(jīng)行小腹冷痛、腰部疼痛，青春期功能失調(diào)性子宮出血、上節(jié)育環(huán)后出血見(jiàn)上述證候患者[1]。中成藥復(fù)方制劑具有多組分、多靶點(diǎn)和整體作用的特點(diǎn)，通過(guò)各成分相互作用，達(dá)到臨床治療的效果，降低不良反應(yīng)，多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式近年來(lái)已逐步應(yīng)用于中藥及其制劑中。春血安膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]和文獻(xiàn)報(bào)道[2]中僅對(duì)佐藥黃連所含的鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀進(jìn)行了定量控制，未對(duì)處方中君藥和其他藥材所含成分進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)選取方中熟地黃和鹽車前子[3]所含活性成分毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1，肉桂所含特征成分肉桂酸和桂皮醛，澤瀉[4]所含代表性成分澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B為檢測(cè)指標(biāo)，建立能同時(shí)測(cè)定春血安膠囊中8種成分含量的HPLC法，為更加全面地評(píng)價(jià)春血安膠囊的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Ulti Mate3000型高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；CPA225D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500E型臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 毛蕊花糖苷(批號(hào)111530-201914，CAS號(hào)：61276-17-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.2%)、肉桂酸(批號(hào)110786-201604，CAS號(hào)：140-10-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.8%)、桂皮醛(批號(hào)110710-201821，CAS號(hào)：14371-10-9，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%)和23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品(批號(hào)111846-201705，CAS號(hào)：26575-95-1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；焦地黃苯乙醇苷B1對(duì)照品(批號(hào)CFS201802，CAS號(hào)：120406-37-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)，購(gòu)于武漢天植生物技術(shù)有限公司；澤瀉醇F(批號(hào)PRF9041322，CAS號(hào)：155521-45-2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)和24-乙酰澤瀉醇A對(duì)照品(批號(hào)PRF8050342，CAS號(hào)：18674-16-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%)，均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；澤瀉醇A對(duì)照品(批號(hào)15071422，CAS號(hào)：19885-10-0，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.9%)，購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。乙腈為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。春血安膠囊(規(guī)格：每粒0.5 g，批號(hào)：A08004，A08007，A08012)，均購(gòu)于天津宏仁堂藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃。乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脫(0～8.0 min，15.0%A；8.0～14.0 min，15.0%A～22.0%A；14.0～25.0 min，22.0%A～52.0%A；25.0～43.0 min，52.0%A～78.0%A；43.0～50.0 min，78.0%A～15.0%A)。流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為330(0～14.0 min檢測(cè)毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1)[5-15],280(14.0～25.0 min檢測(cè)肉桂酸和桂皮醛)[16-18]和208 nm(25.0～50.0 min檢測(cè)澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B)[19-21]。

2.2溶液的配制

2.2.1混合對(duì)照品溶液 精密稱取8種成分對(duì)照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.536，0.992，0.178，2.814，0.132，0.276，0.228，0.892 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL，用甲醇定容至50 mL，制成8種成分質(zhì)量濃度分別為126.8，49.6，8.9，140.7，6.6，13.8，11.4，44.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取春血安膠囊20粒，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取4.0 g，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷后用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3陰性樣品溶液 按照《中國(guó)藥典》2015年版一部春血安膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方工藝，分別制備缺肉桂、澤瀉、熟地黃和鹽車前子的陰性樣品，再按照2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液及空白溶劑(甲醇)各適量，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，在與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品色譜圖中8種成分色譜峰峰形對(duì)稱，與相鄰雜質(zhì)峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按照各成分色譜峰計(jì)算均≥4 500；圖1C中未見(jiàn)毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1色譜峰，圖1D中未見(jiàn)肉桂酸和桂皮醛色譜峰，圖1E中未見(jiàn)澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B色譜峰，表明陰性樣品對(duì)春血安膠囊中8種成分的同時(shí)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4線性關(guān)系 精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分別用甲醇定容至20 mL，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，檢測(cè)8種成分的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，見(jiàn)表1。

表1 春血安膠囊中8種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得8種成分峰面積的RSD值分別為0.66%，0.71%，1.09%，0.57%，1.15%，0.98%，1.03%，0.84%，表明實(shí)驗(yàn)精密度良好。

圖1 HPLC圖

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批春血安膠囊，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定8種成分的峰面積，計(jì)算得峰面積的RSD值分別為1.17%，1.23%，0.76%，1.02%，0.88%，1.55%，1.69%，1.47%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的同一份供試品溶液(臨用新配)，分別于0，2，4，6，12和18 h進(jìn)樣檢測(cè)8種成分的峰面積，結(jié)果峰面積的RSD值分別為0.63%，0.69%，1.05%，0.59%，1.18%，1.27%，1.06，0.89%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8平均回收率 取8種成分含量已知的同一批春血安膠囊，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取2.0 g，共9份，每3份隨機(jī)分為1組，置于25 mL量瓶中，依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部要求，分別加入另行配制的混合對(duì)照品溶液(8種成分質(zhì)量濃度分別為1.718，0.712，0.104，1.848，0.078，0.152，0.128，0.496 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5 mL，使對(duì)照品加入量為樣品含有量的50%，100%，150%，再按照2.2.2項(xiàng)下方法制成加樣供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)8種成分的峰面積，計(jì)算各成分含量，用測(cè)得量與原有量之差除以對(duì)照品加入量計(jì)算8種成分的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9含量測(cè)定 取3批春血安膠囊，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各批次平行3份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)8種成分的峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8種成分的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1待測(cè)物的選擇 春血安膠囊是由熟地黃、鹽車前子、肉桂、澤瀉、柴胡、山藥、附片(黑附片)、三七、牡丹皮、茯苓、黃連、五味子(酒蒸)和牛膝13味中藥材配伍制成的，方中熟地黃補(bǔ)血滋陰、益精填髓，山藥生津益肺、補(bǔ)腎澀精，合為君藥；肉桂、附片(黑附片)補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸元、溫經(jīng)止痛，三七、牡丹皮活血祛瘀、止血定痛，合為臣藥；澤瀉利水滲濕、泄熱化濁，鹽車前子清熱滲濕、利尿通淋，茯苓利水滲濕，柴胡疏肝調(diào)氣，黃連清熱涼血，五味子(酒蒸)滋補(bǔ)肝腎、收斂止血，合為佐藥；牛膝補(bǔ)肝腎、固沖任、強(qiáng)筋骨、壯腰膝，引諸藥直達(dá)腎經(jīng)，為使藥。諸藥配伍，相互協(xié)調(diào)、制約，共達(dá)益腎固沖、調(diào)經(jīng)止血之功。依據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，以君藥所含主要成分為首選，同時(shí)兼顧臣、佐、使藥所含成分，選取君藥熟地黃和佐藥鹽車前子所含活性成分毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1，臣藥肉桂所含特征成分肉桂酸和桂皮醛，佐藥澤瀉所含代表性成分澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B為待測(cè)物，以期全面評(píng)價(jià)春血安膠囊的質(zhì)量。

3.2提取條件的篩選 春血安膠囊方中附片、三七、柴胡和黃連均是細(xì)粉直接入藥，其他成分經(jīng)水提加工后入藥，為確保待測(cè)物提取完全，實(shí)驗(yàn)初期，采用加熱回流提取60 min的同一條件，對(duì)提取溶劑(體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇[5-10，12，22]、甲醇[11-17，23]、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇)進(jìn)行對(duì)比考察，結(jié)果以甲醇為提取溶劑時(shí)，8種成分綜合提取率最佳，雜質(zhì)干擾較??；遂對(duì)不同提取方法(超聲[8-13，15-21]提取和加熱回流[7，14]提取)及不同提取時(shí)間(15，30，60 min)進(jìn)行對(duì)比考察，結(jié)果超聲提取15 min時(shí)待測(cè)物肉桂酸和桂皮醛提取不完全，超聲提取30，60 min時(shí)所得結(jié)果無(wú)明顯差異，考慮到溶液制備的便捷性，最終選取甲醇超聲提取30 min制備供試品溶液。

3.3流動(dòng)相的選擇 考慮到甲醇存在紫外末端吸收，實(shí)驗(yàn)中參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)乙腈-水[18-21]、乙腈-1 mL·L-1甲酸[6，22，24]、乙腈-1 mL·L-1磷酸[5，7，10-12，15-17]和乙腈-1 mL·L-1冰醋酸[8-9，13-14]流動(dòng)相體系進(jìn)行對(duì)比考察，結(jié)果顯示，以乙腈-1 mL·L-1磷酸為流動(dòng)相時(shí)基線平穩(wěn)，8種成分色譜峰峰形較好，與相鄰色譜峰分離效果較好，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相比例的不斷優(yōu)化，最終確定采用乙腈-1 mL·L-1磷酸為流動(dòng)相按照2.1項(xiàng)下流動(dòng)相比例對(duì)春血安膠囊中8種成分的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC法對(duì)春血安膠囊中8種成分的含量進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，建立了春血安膠囊多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，該方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為提高春血安膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和綜合評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。