王巍偉 王珊珊 張 曼

(1. 首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科， 北京 100038； 2. 首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院臨床檢驗中心,北京 100038； 3. 尿液細胞分子診斷北京市重點實驗室， 北京 100038)

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，占所有癌癥死亡人數(shù)的1/4以上[1]。而大約85%的肺癌患者為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，NSCLC是肺癌的主要病理類型,NSCLC又包括肺腺癌、肺鱗癌、肺大細胞癌。盡管肺癌的診療技術不斷進步，但是非小細胞肺癌患者的5年生存率仍在15%左右[1]。這主要是由于肺癌的生物學特性十分復雜，被確診時多已進入晚期，而且目前缺乏治療腫瘤轉移的有效手段[2]。因此，迫切需要早期檢測肺癌以降低病死率。因此，如何簡單、無創(chuàng)、有效地篩查NSCLC并預測患者的生存情況一直是臨床工作關注的重點之一。腫瘤標志物是指由腫瘤組織或宿主與腫瘤相互作用所產(chǎn)生的一類活性物質(zhì)，能夠提示腫瘤存在與生長變化。肺癌的標志物可存在于血漿、肺泡灌洗液、尿液或組織中。腫瘤標志物檢測具有操作便捷、標本易獲取、易于動態(tài)監(jiān)測疾病等優(yōu)點，是肺癌的重要輔助診斷手段[3-5]。激肽原1(kininogen 1，KNG1)是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，具有抗血管生成并介導抑制內(nèi)皮細胞增生的特性[6]。最近，研究[7]顯示KNG1可作為結直腸腺瘤和結腸直腸癌的血清生物標志物。唾液中的KNG1可用于輔助診斷口腔鱗狀細胞癌及監(jiān)測篩查口腔癌的高危人群[8]。然而，目前關于KNG1在NSCLC患者的研究很少。本研究目的是通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)評估不同體液中的KNG1的濃度是否可能是潛在的NSCLC標志物，通過免疫組織化學法檢測NSCLC組織中的KNG1的表達情況，了解其在NSCLC患者中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年10月至2017年3月，在首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院病理確診的NSCLC患者40例作為病例組，其中男性26例、女性14例，年齡34～82歲,平均年齡(64.2±9.0)歲。非肺癌的呼吸系統(tǒng)異?；颊?0例作為對照組。所有NSCLC患者均有病理診斷，并根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟和美國癌癥聯(lián)合委員會[9]頒布的標準進行TNM分期。其中肺癌患者的病理類型：肺腺癌20 例，肺鱗癌20 例；臨床分期：早期肺癌(Ⅰ、Ⅱ期)16例，中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)24例，合并胸膜轉移患者5例，無胸膜轉移34例，合并淋巴結轉移患者31例，無淋巴結轉移9例。良性的呼吸道異常疾病包括慢性咳嗽、支氣管炎、咯血、結節(jié)病、肺結核、支氣管擴張及良性的肺結節(jié)。納入標準：①年齡18～85歲；②病理確診為NSCLC。排除標準：①合并其他部位腫瘤者;②收集標本前已進行手術、放謝治療、化學藥物治療、免疫治療者;③進行腎功能和尿沉渣檢查，尿樣本顯示肉眼、鏡下血尿，尿微量白蛋白/肌酐比(Alb/Cr)<30 mg/g。另外，還留取了40例NSCLC手術患者的癌組織及癌旁對照組織。其中腺癌標本20例，鱗癌標本20例。癌旁正常組織距離腫瘤至少5 cm。本研究方案經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院倫理委員會批準,倫理學審批號:2014-5。

1.2 體液標本采集

所有入選者空腹，抽取靜脈血4 mL并EDTA抗凝，4 ℃，3 600 g離心10 min后，取上層血漿，-80 ℃保存待測。

收集NSCLC患者和對照組的清晨中段尿約50 mL，400 g條件下離心15 min去除細胞碎片等，保留上清，分裝后儲存在-80 ℃冰箱。

用2%(體積分數(shù))利多卡因?qū)崿F(xiàn)局部麻醉。采用奧林巴斯BF 240型支氣管鏡行氣管鏡檢查采樣。在刷片或活組織檢查之前進行灌洗以避免血液污染。將支氣管鏡末端緊密嵌入病變所在的段或亞段支氣管開口處，經(jīng)支氣管鏡活檢孔分5次注入37 ℃ 0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)100 mL 至肺段或肺亞段，每次注入后立即在50～100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)負壓吸引回收液，回收的40 mL以上的肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)被認為是可接受的質(zhì)量水平。然后立即將BALF 1 500 g離心10 min，得到的無細胞成分的上清液后在-80 ℃冷凍保存。

1.3 體液標本檢測

1.3.1 ELISA檢測KNG1在血漿、BALF和尿液中的濃度

血漿、BALF和尿液中的KNG1濃度檢測使用市售ELISA試劑盒(KNG1, 美國Abnova公司)，按照生產(chǎn)商說明書的要求和步驟進行檢測。血漿和BALF 樣本分別稀釋200倍、100倍。然后把血漿、BALF和尿液的樣本在KNG1 ELISA板中孵育,使用680型酶標儀(美國BIORAD公司)在450 nm處測量吸光度。使用標準樣品的濃度和每個孔的相應吸光度值繪制每個平板的標準曲線。試驗中使用了陽性對照和陰性對照。

1.3.2 免疫組織化學法檢測

術中獲得的NSCLC和癌旁正常組織經(jīng)10%(質(zhì)量分數(shù))甲醛固定，石蠟包埋，切成 4 mm切片。二甲苯中脫蠟20 min，在100%、100%、95% 和75%(體積分數(shù))乙醇中脫水，各2 min。在磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline, PBS)中漂洗5次10 min后，高壓修復抗原。然后用PBS液洗滌玻片10 min，在3%(體積分數(shù))H2O2中孵育15 min，再次PBS沖洗10 min?？乖迯秃螅瑯颖九c的KNG1抗體(1∶200)在4 ℃孵育過夜。然后用 PBS 洗滌樣本，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(北京中山金橋生物技術公司)在 37 ℃孵育20 min，PBS洗滌15 min。3,3′-二氨基聯(lián)苯胺溶液(北京中山金橋生物技術公司)染色5 min，蘇木精復染2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯清洗，天然樹膠密封。免疫組織化學法均設陽性及陰性對照。

每張切片隨機選取10個高倍視野(1 000×)，根據(jù)染色強度和面積對每個樣品進行評分。染色強度評分：0為無染色;1為輕度染色; 2為中度染色和3為強烈染色。 陽性細胞百分比分為五類：0為無染色;1為1%～10%; 2為11%～50%; 3為51%～80%; 4為81%～100%。 將染色強度和百分比相乘以產(chǎn)生總分?？偡?～12被定義為陽性表達，0～3被認為是陰性表達[9]。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 基本情況

病例組與對照組患者基本特征見表1，組間年齡、性別、吸煙史差異無統(tǒng)計學意義。

表1 兩組基本特征比較Tab.1 Demographics of two groups n(%)]

病理類型：肺腺癌20例，肺鱗癌20例；臨床分期：早期肺癌(Ⅰ、Ⅱ期)17例，中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)23例。40例患者均無胸膜轉移，合并淋巴結轉移患者30例，無淋巴結轉移10例。不吸煙患者20例，有吸煙史患者20例。

2.2 KNG1在NSCLC和對照組的血漿、BALF和尿液中濃度

NSCLC患者血漿、BALF和尿液中的KNG1濃度均高于對照組(P<0.001),詳見表2。腺癌和鱗癌患者中的KNG1濃度在血漿、BALF和尿液中比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表3。NSCLCⅠ+Ⅱ期患者與Ⅲ+Ⅳ期患者的KNG1濃度在血漿、肺泡灌洗液和尿液中比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表4。

表2 兩組患者的血漿、BALF和尿液中KNG1濃度Tab.2 Plasma, BALF and urine concentrations of KNG1 of two groups

表3 肺腺癌和肺鱗癌患者的血漿、BALF和尿液中KNG1濃度Tab.3 Plasma, BALF and urine concentrations of KNG1 in LUAD patients and LUSC patients

表4 不同分期非小細胞肺癌患者的血漿、BALF和尿液中KNG1濃度Tab.4 Plasma, BALF and urine concentrations of KNG1 in NSCLC patients with different stage

2.3 KNG1對NSCLC的診斷價值

各標本中KNG1的ROC曲線下面積均>50%(P<0.05)。根據(jù)Youden指數(shù)診斷NSCLC的最佳預測臨界值血漿為1 653.6 mg/L，BALF為52.1 mg/L，尿液為2.3 mg/mL，以此診斷的結果顯示，尿液的一致性最高(Kappa=0.59)，尿液診斷效果優(yōu)于血漿和BALF，詳見表5。

表5 KNG1在血漿、BALF和尿液中的診斷參數(shù)Tab.5 Diagnostic parameters of KNG1 in plasma, BALF and urine

2.4 KNG1在NSCLC、癌旁正常組織中的表達

免疫組織化學法檢測結果顯示KNG1蛋白主要在細胞質(zhì)中表達(圖1)。 在40例NSCLC患者腫瘤組織中,其中有19例出現(xiàn)KNG1的表達，陽性表達率為47.5%；而在相對應的40例NSCLC患者癌旁正常組織中，KNG1的陽性表達率僅為10% (4/40)，二者陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表6)。鱗癌和腺癌組織中KNG1的陽性表達率分別為45%(9/20)、50%(10/20)，差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)。

圖1 免疫組織化學法檢測KNG1在非小細胞肺癌及癌旁正常組織中的表達Fig.1 Expression of KNG1 in NSCLC tissues and adjacent normal lung tissues immunohistochemistry(1 000×)A: lung adenocarcinoma cell； B: adjacent normal lung tissues； C: lung squamous cell carcinoma； D: adjacent normal lung tissues. KNG1： kininogen 1； NSCLC： non-small cell lung cancer; bronchoalveolar lavage fluid.

表6 KNG1在非小細胞肺癌及癌旁正常組織中的表達Tab.6 Expressions of KNG1 in NSCLCs and adjacent normal lung tissues

3 討論

肺癌患者生活質(zhì)量和生存率的提高，主要依賴于肺癌的及時診斷治療，甚至是對高危人群的簡單、無創(chuàng)、容易接受的篩查手段。腫瘤標志物在肺癌的早期診斷及治療的預后判斷方面有著重要作用。腫瘤標志物主要存在于腫瘤細胞或宿主體液中。鑒定體液中的生物標志物對肺癌檢測非常有意義。由于對血液蛋白質(zhì)組的豐富認識，血液是發(fā)現(xiàn)生物標志物的最常用標本。而BALF與肺組織相互作用密切，可直接反映肺的狀態(tài)，在一定程度上與肺活檢具有一定的等效性[4]。尿液可通過無創(chuàng)的手段采集，可反復獲得足夠的樣本數(shù)量，用于生物標志物檢測更能令患者接受[3]。此外，由于尿中蛋白水解降解水平較低，尿蛋白更趨向于穩(wěn)定，是非常有前景的肺癌標志物標本。

在本研究探討KNG1在血漿、BALF和尿液以及NSCLC腫瘤組織中的表達情況。KNG1在NSCLC的血漿、BALF及尿液中較對照組升高，且KNG1的濃度在血漿中顯著高于在BALF中，BALF中KNG1濃度顯著高于在尿液中的濃度。KNG1在血漿、BALF和尿液中的表達水平均和腫瘤的分期相關。腺癌和鱗癌的水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。且KNG1在尿中的ROC曲線下面積為0.81，在BALF中的AUC值為0.89，進一步說明BALF中的KNG1可能是潛在的NSCLC生物標志物。

KNG1由KNG1基因編碼，是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，可被切割成6個亞鏈，在血液凝固中發(fā)揮重要作用。越來越多的證據(jù)[6，10-15]證明KNG1在致癌中的作用，它在不同的腫瘤中表達水平不同。在乳腺癌[11]、宮頸癌[6]、子宮內(nèi)膜癌[6]、卵巢癌[12]、腎細胞癌[13]患者的尿液中，KNG1的濃度較低。此外，KNG1在膠質(zhì)瘤細胞[14]和腎細胞癌組織[11]中低表達。相反，其他研究表明肝細胞癌[16]、胃癌[17]和結直腸癌[7]患者血漿中 KNG1濃度升高。免疫組織化學法檢測結果顯示，結直腸癌和進展期大腸腺瘤組織中KNG1的表達明顯高于正常黏膜[18]。生物信息學分析顯示，KNG1可能在結直腸癌肝轉移過程中發(fā)揮重要作用[19]。另外KNG1在其他體液中，如口腔鱗狀細胞癌患者的唾液[8]和膽管癌和胰腺癌的膽汁也升高[20]。在本研究中，與對照組相比，NSCLC患者的血漿、BALF和尿KNG1水平均顯著升高。40例手術切除的NSCLC和癌旁正常組織的免疫組織化學結果顯示，與非腫瘤組織相比，KNG1在腫瘤細胞中的表達顯著增高，可能NSCLC患者的血漿、BALF 和尿液中 KNG1的表達上調(diào)來自于癌細胞產(chǎn)生的增多。盡管KNG1在癌癥中的作用機制還不清楚，但KNG1能抑制內(nèi)皮細胞的增生、遷移，抑制新生血管形成，其在癌癥患者中的表達下調(diào)可能與癌細胞的存活相關[6]。研究[14]顯示，異常的ceRNA介導的KNG1調(diào)控，有助于膠質(zhì)母細胞瘤誘導的血管生成，這為膠質(zhì)母細胞瘤的新治療策略的發(fā)展提供了潛在的靶點。另一項研究[21]顯示，KNG1是引起肝癌治療中非常重要的靶向藥物索拉非尼耐藥的核心基因。所以KNG1不僅和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后有關，還可能和腫瘤的治療和耐藥相關，需要進一步的研究。

KNG1蛋白是在NSCLC與正常組織中的差異表達蛋白，KNG1基因表達水平和NSCLC患者的預后相關，對NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移可能起著重要的促進作用。而在體液，特別是尿液中測定KNG1是一種簡單、無創(chuàng)并且可大量、反復獲取標本的方法，所以，血漿、BALF，尤其是尿液中的KNG1有望成為NSCLC的潛在腫瘤標志物，在NSCLC的輔助診斷和高危人群的篩查甚至預后判斷方面可能起到很好的作用。