胡小軍 訾璐 劉雅婷 李玉婷

(1武漢市普仁醫(yī)院，湖北 武漢 430081；2湖北中醫(yī)藥大學(xué))

糖尿病在中醫(yī)角度歸為“消渴證”，《內(nèi)經(jīng)》中稱為“消癉”，病因主要為陰虛津虧、燥熱偏盛，其中燥熱為標(biāo)、陰虛為本。中醫(yī)認(rèn)為，其主要病變部位在肺、胃、腎，基本病機(jī)為陰津虧耗，燥熱偏盛?！督饏T要略》有專篇對(duì)消渴的證治進(jìn)行闡述，立有白虎加人參湯、腎氣丸等有效方劑，至今為臨床醫(yī)家所推崇。本研究自擬茶方為課題組針對(duì)氣陰兩虛合并氣滯血瘀型消渴癥患者擬定的基礎(chǔ)方，臨床使用時(shí)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行隨癥加減，并聯(lián)合針灸對(duì)糖尿病患者的血糖進(jìn)行控制。針灸聯(lián)合自擬茶方可較好的控制糖尿病患者血糖水平，且可有效的改善胰島素抵抗情況〔1〕。臨床中對(duì)糖尿病患者經(jīng)針灸聯(lián)合自擬茶方治療過(guò)程中的血脂水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明該方法亦可有效控制糖尿病患者的體重及血脂水平〔2〕。肥胖是胰島素抵抗的重要危險(xiǎn)因素，肝臟是脂類代謝的重要場(chǎng)所〔3～6〕，也是胰島素作用的主要靶器官，在胰島素抵抗的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本文通過(guò)針灸聯(lián)合自擬茶方對(duì)脂肪肝大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 儀器：全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Perkin Elmer，EnSpire型)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(力康生物醫(yī)療科技控制有限公司，Neofuge 15R型)；全自動(dòng)生化分析儀(意大利樂高特儀器公司，ECHO型)；潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2FD型)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，RM2016型)；成像系統(tǒng)(日本尼康株式會(huì)社，DS-U3型)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司，GelDocXR型)。試劑：二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)2015032589)；肝組織腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)2017-ASB2559)；p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)2017-XXD1269)；過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)-γ抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)2017-BBH0052)。

藥品制備：自擬茶方基本方(黃芪、桑葉、葛根各3 g，赤芍、白芍、玉竹、羅漢果、三七粉各2 g)按照配伍比例混合后加入1 000 ml水浸泡20 min后，武火煎煮至沸騰，自沸騰起開始計(jì)時(shí)，轉(zhuǎn)為文火煎煮20 min，濾出煎液，加入6倍量水進(jìn)行二煎，合并兩次煎液后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速，溫度)進(jìn)行濃縮，將煎液濃縮至灌胃濃度。

1.2建模及分組給藥 SPF級(jí)SD雌性大鼠40只，體重180～220 g，將大鼠置于溫度25℃，相對(duì)濕度是100%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及治療組，每組10只。每組大鼠均自由飲水，對(duì)照組大鼠以常規(guī)飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。

造模方法：模型級(jí)、陽(yáng)性對(duì)照組及治療組以高脂飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。每周測(cè)量大鼠體重，飼養(yǎng)8 w后，對(duì)模型組大鼠進(jìn)行高胰島素-正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算葡萄糖輸注率(GIR)以驗(yàn)證胰島素抵抗肥胖大鼠模型是否建立成功。GIR=穩(wěn)定期葡萄糖的平均輸入速度×178/(60×體重×微量泵校正系數(shù))〔7〕。

陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予吡格列酮生理鹽水溶液，治療組灌胃給予自擬茶方并聯(lián)合針灸治療，對(duì)照組及模型組給予等量生理鹽水，按照上述方法每日上午給藥1次，給藥14 d，給藥期間對(duì)照組繼續(xù)予以常規(guī)飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及治療組給予高脂飼料，各組大鼠均自由飲水及攝食。14 d后以10%水合氯醛0.3 ml/g腹腔注射麻醉大鼠，以腹主動(dòng)脈采集血液及肝臟組織進(jìn)行后期測(cè)定。

1.3肝指數(shù)的計(jì)算 取肝臟組織后稱量肝濕重，計(jì)算肝臟指數(shù)，公式：肝指數(shù)(%)=肝濕重/體重×100%〔8〕。

1.4切片的制作 取大鼠肝臟組織在10%多聚甲醛中固定24 h以上，在不同濃度的乙醇溶液(70%、85%、95%和100%)中脫水，然后以萊卡(LEICA)石蠟包埋，后縱向切片(厚度為4 μm)并進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，以中性樹脂進(jìn)行封片后置于顯微鏡下觀察。

1.5生化指標(biāo)測(cè)定 采用全自動(dòng)生物儀測(cè)定大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.6組織勻漿TG、TC、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè) 將大鼠肝臟組織勻漿后，以全自動(dòng)生化儀檢測(cè)肝臟組織中TG、TC、MDA及SOD含量。

1.7免疫印跡測(cè)定AMPK、p38 MAPK和PPARγ表達(dá) 取肝臟組織清洗后，以RIPA裂解液于冰上對(duì)組織進(jìn)行裂解，徹底裂解后置于4℃低溫離心機(jī)中，以12 000 r/min離心15 min，取上清液。以BCA法測(cè)定蛋白總量，并以丙烯酰胺、鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS-Hcl)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過(guò)硫酸銨(AP)及四甲基乙二胺(TEMED)配膠，隨后進(jìn)行灌膠、上樣、電泳操作。以甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉后，加入一抗于4℃孵育過(guò)液，以TBST進(jìn)行洗膜，5 min/次，清冼3次。加入二抗，于室溫下進(jìn)行孵于30 min，以TBST洗PVDF膜，5 min/次，清冼3次。以電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑進(jìn)行發(fā)光，置于成像分析系統(tǒng)中〔9，10〕。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肝指數(shù) 模型組肝指數(shù)〔(3.97±0.33)%〕高于對(duì)照組〔(2.81±0.28)%，P<0.05〕，陽(yáng)性對(duì)照組〔(3.25±0.15)%〕與治療組肝指數(shù)〔(3.18±0.21)%〕均低于模型組(P<0.05)，治療組肝指數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.2肝組織形態(tài) 對(duì)照組肝臟組織中肝小葉結(jié)構(gòu)完整且清晰，肝臟細(xì)胞形態(tài)正常；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)較為模糊，可見彌漫性的肝臟細(xì)胞脂肪變性，同時(shí)可見大泡性脂肪變性與小泡性脂肪變性，且伴隨炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；陽(yáng)性對(duì)照組及治療組中亦可見彌漫性脂肪變性，但其脂肪變性的面積及程度及炎癥浸潤(rùn)情況與模型組相比較均有所減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理切片(×400)

2.3各組血清各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 模型組TC、TG、LDL-C、ALT、AST、ALP、IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯高于對(duì)照組，HDL-C水平明顯低于對(duì)照組(均P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組與治療組血清中TC、TG、LDL-C、ALT、ALP、IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組，HDL-C明顯高于模型組(均P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組血清中AST水平明顯低于模型組(均P<0.05)。治療組血清中TG、LDL-C、ALP、IL-6水平與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異顯著(均P<0.05)。見表1。

表1 各組血脂比較

2.4各組肝組織TC、TG、SOD、MDA指標(biāo)比較 模型組肝組織TC、TG、MDA水平明顯高于對(duì)照組，SOD水平明顯低于對(duì)照組(均P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組TC、TG、MDA水平明顯低于模型組，SOD水平明顯高于模型組(均P<0.05)。治療組TG、MDA水平明顯低于模型組，SOD水平明顯高于模型組(均P<0.05)。治療組與陽(yáng)性對(duì)照組肝組織中TC及TG水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。治療組肝臟SOD水平高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，治療組肝臟MDA水平低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組肝組織勻漿指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較

2.5各組AMPK、p38MAPK和PPARγ蛋白表達(dá)比較 模型組肝臟組織中AMPK及PPARγ表達(dá)明顯低于對(duì)照組，p38MAPK表達(dá)明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組、治療組肝臟組織中AMPK及PPARγ表達(dá)明顯高于模型組，p38MAPK表達(dá)明顯低于模型組(均P<0.05)。治療組AMPK與PPARγ表達(dá)與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異顯著(均P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 大鼠肝臟組織中各蛋白表達(dá)結(jié)果

表3 各組AMPK、p38MAPK和PPARγ蛋白表達(dá)比較

3 討 論

《素問(wèn)》有云“膏梁之變，足生大疔”，飲食肥甘厚膩及機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂是產(chǎn)生胰島素抵抗的重要原因。自擬茶方由黃芪、桑葉、葛根、赤芍、白芍、玉竹、羅漢果及三七粉組成，黃芪為常用補(bǔ)氣藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汁、利水消腫等功效，桑葉可疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥，葛根具解肌退熱、生津止渴之功效，赤芍具清熱涼血之功，白芍有斂陰止汗之效，羅漢果可清熱潤(rùn)肺，玉竹可養(yǎng)陰潤(rùn)燥、生津止渴，三七具有散瘀止血、消腫定痛的功效，諸藥合用可清熱潤(rùn)燥、固表止汗以治標(biāo)，又具養(yǎng)陰益氣之效以治本。全方共奏益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)之功，以改善咽干口燥、倦怠乏力，多食易饑，口渴喜引、五心煩熱、心悸失眠、便秘舌紅少津苔薄或花剝，脈細(xì)數(shù)無(wú)力或細(xì)弦等癥狀。

自擬茶方聯(lián)合針灸治療在臨床上有效地改善患者的胰島素抵抗情況〔11〕。肝指數(shù)及血清肝酶的情況可反映肝功能情況，血脂及肝勻漿中TG及TC水平反映大鼠脂質(zhì)代謝情況，炎癥因子則與胰島素敏感及脂質(zhì)代謝紊亂具有相關(guān)性〔11〕。本文結(jié)果表明，自擬茶方聯(lián)合針灸可改善模型大鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性程度，有助于脂肪肝大鼠的肝功能恢復(fù)，可有效地改善大鼠脂代謝紊亂情況，有效降低血脂水平。

AMPK在調(diào)節(jié)能量代謝中對(duì)于葡萄糖攝取及脂肪酸氧化等方面均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，且敲除AMPK基因可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，而特異激活A(yù)MPK可產(chǎn)生胰島素增敏效應(yīng)〔12～14〕；PPARγ是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體的一種亞型，主要在脂肪組織中表達(dá)，研究表明其是胰島素細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、脂肪細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)者，可增加外周組織對(duì)于胰島素的敏感性從而改善胰島素抵抗〔15～18〕；此外，p38MAPK的表達(dá)與脂肪肝大鼠中IL-1、IL-6及TNF-α等炎癥因子的釋放具有相關(guān)性〔19～22〕。本研究結(jié)果提示針灸聯(lián)合自擬茶方對(duì)于脂肪肝大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂及胰島素抵抗的改善作用可能與上調(diào)AMPK及PPARγ表達(dá)、下調(diào)p38 MAPK相關(guān)。