魯廣建 狄文玉 張群妹 焦路陽

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1檢驗(yàn)科，河南 衛(wèi)輝 453100；2病理科；3輸血科)

腎細(xì)胞癌(RCC)是成人泌尿系統(tǒng)常見的腫瘤之一，約占腎臟惡性腫瘤的90%，發(fā)病率為2%～3%〔1〕。全球范圍內(nèi)，RCC約占成年男性惡性腫瘤患者的5%，為男性第7位最常見的癌癥；約占女性惡性腫瘤患者的3%，女性最常見癌癥第10位〔2〕。腎細(xì)胞癌的主要治療方式包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療和生物療法等，其中腎癌根治術(shù)是RCC首選的治療方式〔3，4〕，然而，由于老年惡性RCC患者常常合并慢性基礎(chǔ)疾病，導(dǎo)致其生理功能及耐受性明顯下降，對(duì)于此類患者的治療需考慮其特殊性〔5〕。因此，尋找RCC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制具有重要意義。MicroRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸，可與靶miRNA的3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，影響mRNA的翻譯過程，抑制蛋白質(zhì)表達(dá)，改變細(xì)胞的行為〔6〕。MicroRNA-184(miR-184)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)ang等〔7〕的研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)尿路上皮癌相關(guān)基因(UCA)1通過抑制miR-184表達(dá)促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖和順鉑耐藥；研究發(fā)現(xiàn)，miR-184可通過抑制斯鈣素(Stanniocalcin)-2延緩膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移〔8〕。Ras/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)通路在RCC的生長(zhǎng)過程當(dāng)中起重要作用。本研究以RCC ACHN細(xì)胞為對(duì)象，通過轉(zhuǎn)染miR-184，探討其對(duì)RCC ACHN細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響及相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人RCC細(xì)胞株ACHN購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。miR-184 mimics、miR-NC購(gòu)自廣州睿博生物科技有限公司；RPMI1640、胎牛血清、雙抗購(gòu)自Gibco；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海貝博生物；MTT試劑、BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司；ERK、磷酸化(p)-ERK、GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 ACHN細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每2～3 d進(jìn)行細(xì)胞傳代，并取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，轉(zhuǎn)染miR-184 mimics、miR-NC，48 h后檢測(cè)ACHN細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。

1.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ACHN細(xì)胞消化，離心后以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，24 h后轉(zhuǎn)染miR-184 mimics(miR-184 mimics組)和miR-NC(miR-NC組)，對(duì)照組未做任何處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。24、48 h后，每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除96孔板內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)震蕩混勻，酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處吸光度(OD值)并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(轉(zhuǎn)染組OD-對(duì)照組OD)/對(duì)照組OD×100%。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 在6孔板背后劃5條平行直線后，以2×105個(gè)/孔的密度接種對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ACHN細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁后分別轉(zhuǎn)染miR-184 mimics和miR-NC，對(duì)照組未做任何處理。24 h后，觀察ACHN細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，用黃槍頭在6孔板內(nèi)垂直于背后橫線進(jìn)行劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入無血清的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。分別在0、24、48 h使用倒置顯微鏡拍照并重復(fù)3次，劃痕寬度由Image J軟件進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(0 h寬度-24 h或48 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ACHN細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染miR-184 mimics和miR-NC，對(duì)照組未做任何處理。48 h后將ACHN細(xì)胞收集，PBS洗滌后，離心(1 000 r/min，5 min，4℃)。細(xì)胞重新混懸后置于流式管中，分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V和10 μl碘化丙啶(PI)，15 min內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6q-RT-PCR法 收集miR-184 mimics組、miR-NC組和對(duì)照組細(xì)胞，根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書提取各組ACHN細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度后，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，反應(yīng)條件：42℃ 10 min，30℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min，隨后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃ 5 min(94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s)重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，可得Ct值，根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算可得相對(duì)表達(dá)量。1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)cDNA中的miR-184表達(dá)水平。

1.7Western印跡法 收集miR-184 mimics組、miR-NC組和對(duì)照組細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白濃度由BCA法測(cè)定，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后轉(zhuǎn)膜，洗膜后1%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后加入GAPDH、ERK、p-ERK抗體，4℃搖床孵育過夜，二抗室溫孵育1 h后電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯像，所得圖像由Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-184在ACHN細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況 與對(duì)照組(1.00±0.29)相比，miR-184 mimics組miR-184表達(dá)水平(5.97±0.45)顯著升高(t=21.990，P<0.05)，miR-NC組miR-184表達(dá)水平(0.98±0.05)無顯著性差異(t=0.190，P>0.05)。見圖1。表明miR-184在ACHN細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功。

圖1 凝膠電泳檢測(cè)miR-184表達(dá)

2.2過表達(dá)miR-184對(duì)ACHN細(xì)胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染24 h后，與對(duì)照組〔(91.1±9.2)%〕和miR-NC組〔(89.2±8.0)%〕相比，miR-184 mimics組細(xì)胞存活率〔(65.5±3.1)%〕顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.864，P<0.1)；轉(zhuǎn)染48 h后，與對(duì)照組〔(82.5±8.2)%〕和miR-NC組〔(80.4±7.9)%〕相比，miR-184 mimics組細(xì)胞存活率〔(51.9±2.5)%〕顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.800，P<0.01)。過表達(dá)miR-184后，可顯著抑制ACHN細(xì)胞的增殖能力。

2.3過表達(dá)miR-184對(duì)ACHN細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組〔(6.20±0.30)%〕和miR-NC組〔(6.13±0.23)%〕相比，miR-184 mimics組細(xì)胞凋亡率〔(14.01±0.98)%〕顯著升高(t=17.504，P<0.05)，見圖2。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-184后，促進(jìn)了ACHN細(xì)胞的凋亡。

圖2 過表達(dá)miR-184對(duì)各組細(xì)胞凋亡的影響

2.4過表達(dá)miR-184對(duì)ACHN細(xì)胞遷移能力的影響 見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間過表達(dá)miR-184對(duì)細(xì)胞遷移的影響

轉(zhuǎn)染24 h后，與對(duì)照組〔(0.98±0.08)%〕和miR-NC組〔(0.97±0.06)%〕相比，miR-184 mimics組細(xì)胞劃痕寬度變化〔(1.10±0.07)%〕明顯增加(t1=2.524，t2=3.153，均P<0.05)；48 h后，與對(duì)照組〔(0.76±0.05)%〕和miR-NC組〔(0.78±0.03)%〕相比，miR-184 mimics組細(xì)胞劃痕寬度變化〔(0.91±0.04)%〕顯著增加(t1=5.238，t2=5.814，均P<0.05)。過表達(dá)miR-184后，抑制了ACHN細(xì)胞的遷移能力。

2.5過表達(dá)miR-184對(duì)Ras/MAPK/ERK信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組和miR-NC組相比，miR-184 mimics組p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與對(duì)照組和miR-NC組相比，miR-184 mimics組p-ERK/ERK相對(duì)表達(dá)量顯著下降，見表1、圖4，表明ERK激活受到抑制，即過表達(dá)miR-184可抑制Ras/MAPK/ERK信號(hào)通路。

表1 各組p-ERK蛋白、p-ERK/ERK比較

圖4 Western印跡檢測(cè)各組蛋白表達(dá)水平

3 討 論

全球每年診斷為腎惡性腫瘤的約有20萬人，且發(fā)病率逐年升高〔9〕。RCC位于我國(guó)泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的第二位，隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率逐漸增加〔10〕。Suen等〔11〕對(duì)3 535例老人的尸檢表明，RCC發(fā)病率最高的年齡段是70～75歲，男性高于女性。李東陽等〔5〕對(duì)中青年RCC和老年RCC的臨床資料進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，老年RCC患者病理組織學(xué)類型中進(jìn)展型比例、術(shù)中出血量及術(shù)后住院時(shí)間均高于中青年患者高，嚴(yán)重影響了老年RCC患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，因此，深入了解老年腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。治療RCC首選根治性手術(shù)治療，但是術(shù)后仍有三分之一患者發(fā)生進(jìn)展，且由于對(duì)化療和放療敏感性差，RCC患者的5年生存率低于10%，中位生存率僅為5年〔3,4〕。因此，從基因分子水平等方面研究RCC極其重要。

MicroRNAs是一類廣泛存在于動(dòng)物和植物細(xì)胞內(nèi)的非編碼基因，通過調(diào)控基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、分化和凋亡等過程〔12〕。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在胃癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤過程中起到重要作用，而不同的miRNAs各自發(fā)揮著抑癌或促癌作用〔13,14〕。秦丹丹等〔15〕的研究發(fā)現(xiàn)，在RCC組織中存在miR-30a低表達(dá)，與RCC患者的預(yù)后相關(guān)，且miR-30a可通過MTDH抑制RCC細(xì)胞的增殖;張歡等〔16〕采用miRNA芯片檢測(cè)RCC的腫瘤組織和血清發(fā)現(xiàn)存在miR-106a表達(dá)升高;楊益等〔17〕發(fā)現(xiàn)miR-21 在RCC患者手術(shù)前高表達(dá)，術(shù)后表達(dá)水平降低，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究以對(duì)RCC ACHN細(xì)胞為研究對(duì)象，成功轉(zhuǎn)染了miR-184，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-184抑制了細(xì)胞的增殖能力和遷移能力，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。Wang等〔18〕研究顯示，miR-184通過下調(diào)C-MYC和BCL-2抑制人結(jié)腸癌SW480和HCT116細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，這與本研究結(jié)果一致。

MAPK是與細(xì)胞生長(zhǎng)、有絲分裂、發(fā)育、分化和凋亡等各種生理過程相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，同時(shí)也參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲及凋亡等過程〔19〕。Ras/MAPK/ERK信號(hào)通路，即Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路可根據(jù)MAPK三級(jí)激酶模式活化，Ras激活后為磷酸化的Raf，與RAF結(jié)合的同時(shí)磷酸化Raf，p-Raf激活MEK后，磷酸化的MEK激活ERK，磷酸化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核后啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。在許多腫瘤中常見MAPK信號(hào)通路的異常激活。夏迎晨等〔20〕的研究顯示miR-145通過MAPK信號(hào)通路調(diào)控肺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲；在RCC中上調(diào)ERCC6L可增強(qiáng)體外細(xì)胞活力，促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，這一作用可能于調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路有關(guān)〔21〕。本研究結(jié)果顯示過表達(dá)miR-184抑制p-ERK/ERK相對(duì)表達(dá)量，Ras/MAPK/ERK信號(hào)通路受到了抑制。因此推測(cè)miR-184抑制ACHN細(xì)胞增殖、遷移及促進(jìn)凋亡的作用可能與抑制Ras/MAPK/ERK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，miR-184可能通過調(diào)控Ras/MAPK/ERK途徑抑制老年腎癌ACHN細(xì)胞增殖能力和遷移能力，促進(jìn)ACHN細(xì)胞的凋亡作用，為老年RCC的分子治療提供一個(gè)新思路，也為MicroRNA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。miRNA-184對(duì)RCC的具體作用機(jī)制及生物學(xué)功能仍需進(jìn)一步研究。