張維 于珊珊 尹宏兵

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130000；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院)

鹿茸是雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，是一種特殊的軟骨組織，含有多種活性因子，是鹿體在骨化之前貯存生長(zhǎng)因子最活躍的生長(zhǎng)點(diǎn)。鹿茸多肽是鹿茸主要的生物活性成分物質(zhì)，對(duì)成骨細(xì)胞、造血細(xì)胞、纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)及神經(jīng)生長(zhǎng)都有明顯的促進(jìn)作用。本研究探討超聲破碎法提取梅花鹿茸總多肽的效果及鹿茸總多肽的抗炎活性，為今后鹿茸總多肽的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于后續(xù)研究梅花鹿茸總多肽對(duì)炎癥細(xì)胞的毒性作用的實(shí)驗(yàn)研究具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1鹿茸總多肽的超聲波提取制備方法

1.1.1超聲破碎時(shí)間對(duì)鹿茸總多肽提取的影響 稱取新鮮的梅花鹿茸約20 g，剁成小塊后放入燒杯中，用預(yù)先放于層析柜(4℃)冷卻過的蒸餾水沖洗數(shù)次，直至完全無血色；粉碎機(jī)粉碎，加入預(yù)冷的勻漿液(pH3.5的冰醋酸水溶液)50 ml加入一定量的玻璃珠，置于4℃低溫?fù)u床中6 h后，冰浴條件下超聲破碎(工作5 s,停止3 s)，于超聲破碎的不同時(shí)間(0,10,20,30，40,50,60,80 min時(shí))，吸取混合溶液1 ml,于4℃，10 000 r/min離心15 min后吸取上清液，保存于4℃中，測(cè)定蛋白濃度。

1.1.2制備鹿茸總多肽 稱取新鮮的梅花鹿茸200 g，按照上述的操作方法，加入預(yù)冷的勻漿液500 ml，放于4℃的恒溫?fù)u床中6 h后，冰浴條件下超聲破碎，待超聲結(jié)束后，于4℃，10 000 r/min離心15 min，合并上清液，冷凍干燥獲得粉末。稱取20 mg凍干粉，溶解于1 ml的pH3.5的冰醋酸水溶液中，脫鹽后，保存于-20℃中待用。

1.2應(yīng)用Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝電泳(SDS-PAGE)方法鑒定鹿茸總多肽

1.2.1溶液配制及膠制作 陰極緩沖液由三羥甲基氨基甲烷(Tris)0.1 mol/L，Tricine 0.1 mol/L和SDS 1 g/L配制而成，配制好的溶液用1 mol/g的HCl調(diào)節(jié)pH為8.25。陽極緩沖液由Tris 0.2 mol/L配制而成，配制好的溶液用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為8.9。膠緩沖液由Tris 3.0 mol/L和SDS 3 g/L配制而成，配制好的溶液用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為8.4待用。3C丙烯酰胺貯存液的配制：首先在100 ml純水中溶解 1.5 g N，N′-甲叉雙丙烯酰胺和48.0 g 丙烯酰胺，混勻后，用濾紙過濾待用；6C 丙烯酰胺貯存液的配制是先在100 ml純水中溶解3.0 g N，N′-甲叉雙丙烯酰胺和 46.5 g 丙烯酰胺，之后的處理同3C丙烯酰胺貯存液的配制方法。2×上樣緩沖液是由120 g/L的甘油，4%的SDS，0.1 g/L的溴酚藍(lán)組成，100 mmol/L的Tris和20 ml/L巰基乙醇，混合均勻后調(diào)節(jié)pH為6.8后待用。脫色液的配制：在900 ml 蒸餾水中加入100 ml 乙酸。染色液的配制：在450 ml 蒸餾水中依次加入2.5 g 考馬斯亮藍(lán) R-250、100 ml 乙酸和450 ml 乙醇。凝膠是由分離膠、間隙膠和濃縮膠組成的三層不連續(xù)的結(jié)構(gòu)。按表1進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE膠的配制。

表1 分離膠、間隙膠和濃縮膠的組成

1.2.2上樣與電泳方法 陽極緩沖液裝于外槽，陰極緩沖液裝于內(nèi)槽。按1∶1的比例將上樣緩沖液和蛋白質(zhì)樣品均勻混合，水浴煮沸 5 min。在點(diǎn)樣孔內(nèi)加入10 μl樣品，在另一點(diǎn)樣孔加入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品10 μl。在恒壓40 V條件下跑約1 h，待樣品進(jìn)入間隙膠后，將電壓升至70 V，于恒壓條件下跑至電泳結(jié)束。

1.2.3染色、脫色和膠的保存方法 電泳后的膠可于染色液中震蕩染色 6～7 h，隨后在脫色液中脫色數(shù)次，直至背景清晰可見，膠的保存可參考一般的SDS-PAGE保存條件。

1.2.4蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白濃度，將200 μl的蛋白溶液加入試管中，再加入5 ml的考馬斯亮藍(lán)染色液，渦旋，待反應(yīng)5 min后，應(yīng)用紫外分光光度法于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。

1.3梅花鹿茸總多肽細(xì)胞水平抗炎活性實(shí)驗(yàn)

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞接種在含5% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每天換液，2～3 d傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 應(yīng)用CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：首先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞數(shù)調(diào)至4×105個(gè)/ml，隨后在96孔培養(yǎng)板中每孔接種100 μl RAW264.7細(xì)胞，在37℃、5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，并于2 h后進(jìn)行培養(yǎng)基的更換。設(shè)計(jì)模型組、給藥組和空白對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，調(diào)零選擇空白孔?？瞻讓?duì)照組中只加培養(yǎng)液；模型組需要將終濃度為1 μg/ml的脂多糖(LPS)加入培養(yǎng)液中；同時(shí)給藥組設(shè)計(jì)高，中，低三個(gè)給藥濃度，分別在模型組的基礎(chǔ)上加入10 mg/ml、20 mg/ml和30 mg/ml終濃度的梅花鹿茸總多肽(分別為低、中、高劑量組)。各組細(xì)胞均培養(yǎng)24 h，每孔在無菌條件下加入10 μl的 CCK-8溶液，于避光條件下孵育4 h后，測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)條件下的OD值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活性。細(xì)胞相對(duì)活性=實(shí)驗(yàn)組OD-調(diào)零組OD/(對(duì)照組OD-調(diào)零組OD)。

1.3.3細(xì)胞上清液中IL-6和IL-1β的檢測(cè) 應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6和IL-1β：首先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞數(shù)調(diào)至4×105個(gè)/ml，在24孔培養(yǎng)板的每孔中接種500 μl該細(xì)胞，在條件為37℃、5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育2 h，并隨后更換培養(yǎng)液。分組同1.3.2，各組細(xì)胞培養(yǎng)均24 h，于4℃，3 000 r/min離心10 min。各組細(xì)胞上清液應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)其中的IL-6和IL-1β含量。按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作。

2 結(jié) 果

2.1梅花鹿茸總多肽的超聲波提取分離 超聲0、10、20、30、40、50、60、80 min時(shí)，蛋白質(zhì)濃度分別為：(0.12±0.01)mg/ml、(0.63±0.02)mg/ml、(1.12±0.01)mg/ml、(1.35±0.05)mg/ml、(1.42±0.03)mg/ml、(1.55±0.02)mg/ml、(1.58±0.02)mg/ml、(1.61±0.04)mg/ml；0～40 min，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取到的鹿茸多肽的濃度也在逐漸增大，超聲40～80 min過程中，蛋白質(zhì)的濃度變化不明顯，因而可以選擇超聲破碎時(shí)間為40 min，從而獲得較好的超聲破碎提取鹿茸總多肽的效果。

2.2梅花鹿茸總多肽的 Tricine-SDS-PAGE 初步鑒定 由圖1可以看出，梅花鹿茸多肽在電泳膠中呈彌散狀分布，通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品比對(duì)，可知其分子量分布在14.4～3.3 kD。

圖1 梅花鹿茸總多肽的 Tricine-SDS-PAGE

2.3梅花鹿茸總多肽的抗炎活性研究

2.3.1梅花鹿茸總多肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) 低、中、高劑量組對(duì)RAW264.7細(xì)胞均無毒害作用，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(113.579±1.24)%、(113.137±0.98)%、(115.314±1.19)%、(100.000±0.00%)；P>0.05〕，因此選擇的三種梅花鹿茸總多肽可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3.2梅花鹿茸總多肽對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞 IL-6 的表達(dá)影響 模型組IL-6與空白對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組IL-6含量明顯降低(P<0.05)；抑制效果最佳時(shí)，其鹿茸總多肽的濃度為30 mg/ml。

2.3.3梅花鹿茸總多肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-1β蛋白的表達(dá)影響 與空白對(duì)照組相比，模型組IL-1β顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，低、中、高劑量組IL-1β含量顯著下降(P<0.05)，其抑制效果最佳時(shí)的梅花鹿茸的濃度為20 mg/ml。見表2。

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-6、IL-1β含量比較

3 討 論

追溯到我國古代，人們已經(jīng)開始對(duì)鹿茸的功效進(jìn)行研究，起初人們只認(rèn)識(shí)到鹿茸能夠強(qiáng)身健體,對(duì)提高性功能方面有顯著作用，但隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展，已經(jīng)逐漸證實(shí)鹿茸含有大量的氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)元素、磷脂等脂類物質(zhì)和糖類化合物等復(fù)雜的化學(xué)成分，并具有抗氧化、抗炎作用、提高免疫、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、增強(qiáng)性功能〔1，2〕等廣泛的作用。

鹿茸多肽具有抗炎作用，可降低大鼠腎上腺中膽固醇的含量和抗壞血酸含量，明顯升高血清皮質(zhì)醇含量，具有顯著的抗炎作用，對(duì)各種急慢性炎癥均具有明顯療效。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)即使阻斷垂體后，抗炎作用依然存在，證明鹿茸多肽的抗炎作用機(jī)制不完全依賴于垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)〔3〕。有研究表明中成藥中鹿茸口服液和鹿茸膠囊也具有相同的抗炎功效〔4～6〕在治療和預(yù)防疾病中被廣泛應(yīng)用。分離鹿茸多肽的技術(shù)也在不斷提高，Zha等〔7〕已成功從梅花鹿茸中分離得到一種多肽，該多肽由68個(gè)氨基酸組成且相對(duì)分子質(zhì)量約為7 200 U；周秋麗等〔8〕通過應(yīng)用電泳分離分析和質(zhì)譜分離分析等技術(shù)手段，證明梅花鹿茸多肽的相對(duì)分子質(zhì)量范圍在1 000～3 000 D；隨著分離技術(shù)的不斷提到,目前已有技術(shù)可以從梅花鹿茸中分離得到純度高達(dá)99%且相對(duì)分子質(zhì)量約為30 000 U的一個(gè)單體多肽，張鄭瑤等〔9〕利用氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)檢測(cè)該單體多肽活性，發(fā)現(xiàn)其有對(duì)骨細(xì)胞有極顯著的促進(jìn)增殖作用，尤其是對(duì)經(jīng)過原代培養(yǎng)的核軟骨細(xì)胞和表皮細(xì)胞。梅兵等〔10〕在二杠梅花鹿茸分離得到梅花鹿多肽Ⅰ和Ⅱ，并利用生物效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究，證明梅花鹿多肽組分Ⅰ和Ⅱ均具有抗炎效果及促進(jìn)生長(zhǎng)作用；Sui等〔11〕研究鹿茸多肽是否具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，在梅花鹿茸中分離得到一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為1 479.9 U的多肽，并證明該多肽對(duì)小鼠HT22細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用；王豐等〔12〕從馬鹿茸中分離得到相對(duì)分子質(zhì)量為3 095.1 U的一種多肽，利用凝膠過濾層析法、離子交換層析法及高效液相等技術(shù)手段，表明鹿茸多肽對(duì)表皮細(xì)胞BRL肝細(xì)胞株的增生繁殖有明顯的促進(jìn)作用。鹿茸的抗炎作用的研究仍處于起步階段，對(duì)鹿茸中具有抗炎作用的多肽成分的研究是十分有意義的。本研究結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-6的高表達(dá)能夠被一定濃度的梅花鹿茸總多肽所抑制。

綜上所述，應(yīng)用超聲破碎法提取鹿茸總多肽可以獲得良好的效果；鹿茸總多肽具有抗炎作用，并在不同濃度下抗炎作用效果不同。為今后進(jìn)一步臨床藥理實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。