尹媛 衛(wèi)志慶 朱建國 喬冠群 李英斌 侯道榮 馬駿

(南京醫(yī)科大學 1醫(yī)藥實驗動物中心，江蘇 南京 210029；2第二附屬醫(yī)院血管外科；3第二附屬醫(yī)院影像科；4附屬南京醫(yī)院神經(jīng)外科)

腦動脈瘤(CA)是臨床上最常見的腦血管疾病之一，在普通人群中發(fā)病率為1%～5%〔1〕。大多數(shù)未破裂的CA無癥狀或表現(xiàn)為慢性頭痛等常見癥狀〔2〕。顱內(nèi)動脈瘤破裂是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)最常見的原因。CA破裂是自發(fā)性SAH最常見的原因。SAH在腦血管疾病中占第三位，僅次于腦血栓形成和高血壓性腦出血，其致死率和致殘率都很高，病死率可達25%～50%〔3〕，存活患者還會出現(xiàn)并發(fā)癥。開顱手術和血管介入治療是現(xiàn)有的兩種有效治療手段，但兩種方式均為有創(chuàng)性操作，存在不同程度的手術風險及治療局限性〔4,5〕。因此，尋找有效的CA無創(chuàng)治療方法具有重要意義。丹參酮(Tan)ⅡA 是從中藥丹參中提取的主要成分，其被廣泛用于治療各種疾病，如心血管疾病、糖尿病和癌癥〔6～8〕。有報道稱Tan ⅡA能抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導的磷酸化和核因子(NF)-κB DNA結合，可導致人類主動脈平滑肌細胞(HASMC)遷移并增加基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9活性〔9〕。然而，Tan ⅡA在CA治療中的作用尚未見報道。本研究探討Tan ⅡA在大鼠CA形成中的作用及可能機制，為抑制CA形成提供可能的臨床治療方法。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠16只，體重200～250 g，購自南京醫(yī)科大學醫(yī)藥動物實驗中心，實驗動物合格證號：SCXK(蘇)2016-0002。動物自由飲食并置于恒定環(huán)境〔溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%，12 h晝/夜循環(huán)光照〕下飼養(yǎng)。動物實驗已通過南京醫(yī)科大學動物實驗中心倫理委員會批準。

1.2主要試劑 Tan ⅡA(T4952)購自美國Sigma公司；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；q-PCR試劑盒購自美國Roche公司；互補脫氧核糖核酸(cDNA)合成試劑盒購自日本Takara公司；NF-κB 抗體(ab16502)購自美國Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(AC033)購自美國Abclonal公司；羊抗鼠和羊抗兔二抗購自美國Cell Signaling Technology 公司。顯影液購自美國Thermo公司。

1.3主要儀器 大鼠無創(chuàng)血壓儀購自美國肯特公司；Q-PCR儀(ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司；ChemiDoc MP成像儀購自美國Bio.Rad公司。

1.4方法

1.4.1大鼠CA模型的構建 參考相關文獻制作大鼠CA模型〔10〕。使用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，開腹后在顯微鏡下分離出雙側腎動脈后支予以結扎，術后1 w結扎左側頸總動脈，并使用含有1%氯化鈉的高鹽飲食來誘發(fā)全身性高血壓。手術后的大鼠置于標準設施中飼養(yǎng)。

1.4.2分組和干預 使用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為模型組(CA組)和治療組(CA+Tan ⅡA組)。CA組采用手術和高鹽飲食誘導CA模型；CA+Tan ⅡA組采用手術和高鹽飲食誘導CA后，腹腔注射0.9% NaCl 溶液1 ml 的Tan ⅡA(25 mg/kg)〔11〕，于4 w后處死大鼠。

1.5觀察指標

1.5.1大鼠血壓測量 根據(jù)容量壓力記錄法(VPR)，使用美國肯特動物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測量大鼠尾動脈血壓。每3 d測1次血壓，監(jiān)測其變化。

1.5.2血管蘇木素-伊紅(HE)染色 小鼠處死后主動脈血管取材固定，石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟至水。對蠟塊進行切片(4 μm)，HE 染色后置于載玻片進行固定，光學顯微鏡下觀察血管形態(tài)改變。

1.5.3q-PCR 使用TRIzol試劑盒從大鼠血管組織中提取總RNA。采用cDNA合成試劑盒從RNA樣本中轉錄的cDNA作為模板。Q-PCR反應循環(huán)為94℃，15 s；60℃，30 s；72℃，30 s。反應體系為20 μl。引物序列分別為：NF-κB：上游5′-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3′；下游5′-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3′；單核細胞趨化蛋白(MCP)-1：上游：5′-CCTCCACCACTATGCAGGTCTC-3′；下游：5′-GCACGTGGATGCTACAGGC-3′；MMP-2：上游：5′-CTGATAACCTGGATGCAGTCGT-3′；下游：5′-CCAG CCAGTCCGATTTGA-3′；MMP-9：上游：5′-TTCAAGGACGGTCGGTATT-3′；下游：5′-CTCGAGCCTAGACCCAACTTA-3′；GAPDH：上游：5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′；下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.5.4Western印跡 大鼠腦動脈血管組織蛋白試劑盒說明書提取。組織裂解產(chǎn)物使用10%～15%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，使用5%牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉，目標蛋白孵育一抗過夜。孵育相應辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗。使用顯影液反應1 min后，在ChemiDoc MP成像系統(tǒng)下曝光。使用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1Tan ⅡA抑制大鼠CA的形成 實驗組大鼠術后1 d血壓值開始上升，術后3 d血壓明顯升高，術后30 d時血壓已接近升壓曲線峰值，以后血壓逐漸保持平穩(wěn)。CA組血壓為(154.64±8.65)mmHg，CA+TanⅡA組血壓為(152.86±10.14)mmHg。TanⅡA處理對大鼠術后血壓無明顯影響(P>0.05)。形態(tài)學觀察表明，Tan ⅡA治療對大鼠CA的生長有抑制作用(圖1)。CA組動脈瘤〔直徑(75.67±5.32)μm〕明顯大于Ca+TanⅡA組動脈瘤直徑〔(41.58±4.79)μm，P<0.05〕。CA組血管壁厚為正常血管的(48.12±7.24)%，CA+TanⅡA組血管壁厚為正常血管的(8.12±5.58)%，與CA組相比，Tan ⅡA處理也增加了血管壁厚(P<0.05)。

圖1 Tan ⅡA抑制大鼠CA的形成(HE，×40)

2.2Tan ⅡA降低了CA壁的炎癥反應 CA組動脈瘤中浸潤巨噬細胞數(shù)量為(4.56±2.02)個，CA+TanⅡA組動脈瘤中浸潤巨噬細胞數(shù)量為(3.05±1.69)個。與CA組相比，CA + Tan ⅡA組巨噬細胞浸潤顯著較少(P<0.05)，CA+Tan ⅡA組MCP-1，MMP-2和MMP-9 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組動脈瘤組織MCP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA表達

2.3Tan ⅡA對NF-κB表達的作用 與CA組NF-κB mRNA表達量(0.97±0.12)及蛋白表達量(0.78±0.15)比較CA+TanⅡA組NF-κB mRNA表達水平和蛋白表達水平(0.17±0.04)明顯降低(圖2)。

圖2 Tan ⅡA對NF-κB蛋白表達的作用

3 討 論

丹參是中藥丹參中發(fā)現(xiàn)的一種二萜萘醌，其具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用，在中國廣泛用于癌癥、肝病、糖尿病、心血管疾病的治療〔6～8〕。雖然一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Tan ⅡA在不同人類疾病動物模型中的作用〔12,13〕，Tan ⅡA對CA形成和進展的影響尚未見報道。因此，這是首次在大鼠模型中探討Tan ⅡA在CA形成中的作用。在大鼠模型中，顱內(nèi)動脈分叉處血流動力學應激增加導致炎癥延長，觸發(fā)CA的形成和進展，這與人類的發(fā)病機制一致〔10,14〕。該模型被廣泛用于探討CA的形成機制。在過去的幾十年里，研究發(fā)現(xiàn)CA病變中存在炎癥反應，表明炎癥過程在CA的發(fā)病機制中起著至關重要的作用〔15〕。

CA是一種多基因疾病，近年來，MMPs在CA形成過程中的作用漸受重視〔16,17〕，但其機制尚未闡明。MMPs是一組破壞細胞外基質(zhì)鋅和鈣依賴性的蛋白溶解酶，可以降解細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、非膠原糖蛋白和彈力蛋白，參與細胞外基質(zhì)重構，這些MMPs主要由浸潤的巨噬細胞分泌，在組織重塑中起著至關重要的作用〔18〕。其中MMP-2、MMP-9與CA形成關系最為密切〔19〕。研究證實，MMPs活性異常增高參與了CA的形成〔20〕。在人CA中，患者血清和動脈瘤壁MMP-2和MMP-9的表達顯著升高〔21〕。

MCP-1，MMP-2和MMP-9是NF-κB信號的下游分子。NF-κB調(diào)節(jié)炎癥基因的表達，如白細胞介素(IL)-1，誘導一氧化氮合酶(iNOS)和MMP〔22〕。大量研究表明慢性炎癥在CA的形成和進展中起著重要作用〔15,23〕。NF-κB通過上調(diào)MCP-1表達介導巨噬細胞募集是炎癥反應中的一個重要過程。IL-1和iNOS可引起血管平滑肌細胞凋亡，從而導致血管內(nèi)皮損傷和內(nèi)部彈性層的破壞〔24〕。MMP-2和MMP-9參與膠原降解和破壞導致的血管壁重塑〔25〕。由于其在CA中的重要作用，NF-κB可能成為CA的治療靶標。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Tan ⅡA治療可以防止巨噬細胞浸潤和動脈瘤壁的變性。這種結果是由于對NF-κB和MCP-1表達的抑制。在心肌梗死大鼠模型中也有類似的發(fā)現(xiàn)〔26〕。NF-κB是調(diào)控一系列炎癥相關基因表達的關鍵轉錄因子。慢性炎癥反應如巨噬細胞浸潤，細胞因子釋放和MMPs表達引起的異常，激活了NF-κB，從而促進CA的形成和生長〔27～29〕。據(jù)報道NF-κB p50亞基的缺乏或者使用嵌合誘餌寡核苷酸抑制NF-κB的活性從而抑制CA形成和進程〔22〕。綜上，Tan ⅡA在CA形成過程中，通過抑制NF-κB信號和巨噬細胞浸潤減弱炎癥反應，抑制血管瘤形成。NF-κB信號通路很可能是一個臨床治療CA有前景的靶標。