顏帥 樂(lè)音子 王曉鵬

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009)

胃腸道 Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)是胃腸道慢波活動(dòng)的起搏細(xì)胞，在調(diào)控胃腸道的運(yùn)動(dòng)中扮演重要角色，研究表明ICC數(shù)量、分布、形態(tài)和結(jié)構(gòu)的異常變化與慢傳輸型便秘(STC)發(fā)病有密切關(guān)系〔1，2〕。而ICC細(xì)胞過(guò)度自噬是慢傳輸型便秘大鼠模型中ICC數(shù)量減少的關(guān)鍵，誘發(fā)ICC功能障礙，導(dǎo)致STC發(fā)生〔3～6〕。既往防治便秘的藥物對(duì)ICC的影響多數(shù)還停留在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平，尚缺乏構(gòu)建結(jié)腸 ICC自噬的模型。本研究完善結(jié)腸ICC的消化分離培養(yǎng)技術(shù)，探討結(jié)腸ICC自噬模型的建立，為發(fā)展 ICC的新型藥物或者診療手段提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠30只，雌雄不限，體重200 g左右，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(湘)2016-0002。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)(北京亞泰YT-CJ-2NB)；低速離心機(jī)(知信儀器SL02)；直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱(上海三藤儀器DH-160I)；解剖顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠XTZ-D/E)；倒置顯微鏡(北京中顯恒業(yè)DSZ2000X)；無(wú)菌平皿(美國(guó)Corning)；200目細(xì)胞濾網(wǎng)(BD)；眼科剪刀、鑷子(上海金粒醫(yī)療器械有限公司)；搖床、旋渦混合器(江蘇其林貝爾)；精密PH計(jì)(雷磁E-201-C)；蓋玻片、載玻片(海門遠(yuǎn)泰)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(中國(guó)湖南湘儀H1650R)；電子天平(美國(guó)雙杰JJ224BC)；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(北京六一)；磁力攪拌器(雷磁JB-13)；生物樣品均質(zhì)儀(杭州奧盛BioPrep-24)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 M199培養(yǎng)基(Gbico)；胰酶消化液(美國(guó)Ameresco)；RIPA裂解液、青-鏈霉素(上海碧云天)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Hyclone)；胎牛血清(Gbico)；Ⅱ型膠原酶(COLLAGENASE)；Ⅰ型鼠尾膠原蛋白(北京索來(lái)寶)；L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)；脫氧核糖核酸酶(DNase)Ⅰ(康為世紀(jì))；CCK-8 試劑盒(日本同仁化工)；兔抗大鼠 c-Kit原癌基因蛋白多克隆抗體(abcam)；Tween-20、4%多聚甲醛(上海國(guó)藥生物)；微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3B抗體(美國(guó)proteintech)；β-actin(美國(guó)proteintech)；羊抗鼠IgG(美國(guó)proteintech)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(中國(guó)大連美倫MB2479)；超敏化學(xué)發(fā)光液(美國(guó)advansta)；顯影液、定影液(上海佳信)；甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺(美國(guó)Sigma)。

1.4原代培養(yǎng)大鼠結(jié)腸ICC 細(xì)胞分離用的眼科剪刀、鑷子等器械經(jīng)121℃高溫高壓滅菌30 min取出，160℃烘干，泡新潔爾滅液5 min再泡75%酒精5 min，放于超凈工作臺(tái)紫外殺菌30 min。參照文獻(xiàn)〔7，8〕進(jìn)行優(yōu)化，取SD大鼠，雌雄不限，禁食12 h，脫頸處死，全身快速浸泡于75%酒精3 min，快速取出置于超凈臺(tái)上；縱行切口剖開(kāi)腹腔，取自盲腸后2 cm起的近端結(jié)腸直至距肛門2 cm的直腸，放入直徑10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，用含2%雙抗的PBS將腸內(nèi)容物沖洗干凈；解剖顯微鏡下眼科鑷仔細(xì)剝?nèi)ツc系膜和血管，剪碎至1～2 mm3小塊，放入15 ml離心管內(nèi)，加入Ⅱ型膠原酶消化液7 ml(pH7.0，含1.3 mg/ml Ⅱ型膠原酶)，37℃，充分消化3 h，間隔30 min取出吹打1次；加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，200目篩過(guò)濾后經(jīng)1 200 r/min離心3 min，棄去上清液；加入完全培養(yǎng)基使細(xì)胞重懸；再將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，接種至預(yù)先包被鼠尾膠原蛋白Ⅰ型(2.5 μg/ml)的60 mm培養(yǎng)皿，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后換液，洗去未貼壁細(xì)胞，再加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每天換液1次，期間連續(xù)用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。

1.5結(jié)腸ICC的免疫熒光鑒定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)冰凍甲醇固定10 min，5%脫脂奶粉封閉10 min；加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆抗體(1∶100)，4℃冰箱孵育過(guò)夜，PBST 液沖洗3遍，加入Ⅱ 抗(Dylight488結(jié)合山羊抗兔IgG，1∶200)，37℃培養(yǎng)箱避光孵育1 h，PBST清洗3遍，最后加抗淬滅封片液封片，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6CCK-8法檢測(cè)不同濃度和時(shí)間谷氨酸對(duì)原代結(jié)腸ICC活力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠結(jié)腸ICC細(xì)胞，重懸計(jì)數(shù)后接種于3個(gè)96孔板，20孔/板，共60個(gè)孔，每孔100 μl細(xì)胞懸液，每孔約5×103個(gè)細(xì)胞，24 h后換液待其貼壁后加藥，分別給予谷氨酸0.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L處理大鼠結(jié)腸ICC細(xì)胞，記為空白組、谷氨酸A組、谷氨酸B組、谷氨酸C組，分別培養(yǎng)3、6、24 h。各組加藥培養(yǎng)到預(yù)定時(shí)間后分別加入10 μl CCK-8，37℃，5%CO2繼續(xù)孵育4 h 后，Bio-Tek酶標(biāo)儀450 nm處為吸光度(OD)值檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.7Western印跡檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度谷氨酸對(duì)LC3蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠結(jié)腸ICC細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化離心后計(jì)數(shù)，并接種 2×105個(gè)細(xì)胞至 25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，貼壁24 h后，更換新的培養(yǎng)基；并給不同濃度谷氨酸分別干預(yù) 3 h、6 h 和 24 h 后，分組同1.6部分。蛋白提?。河帽A(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞1次，加入200 μl RIPA裂解液，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，收集懸液，超聲破碎1.5 min；冰上裂解10 min；4℃，12 000 r/min離心15 min。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明操作，測(cè)定蛋白濃度。取120 μl蛋白上清，加入30 μl 5×上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，第一孔點(diǎn)入marker 2 μl，依次上樣10 μl已變性蛋白。開(kāi)始電泳，電泳恒定電壓75 V，時(shí)間為130 min。待溴酚藍(lán)電泳至膠底部時(shí)終止電泳。轉(zhuǎn)膜：分別切膠LC3B(16～18 kD)，β-actin(42 KD)。準(zhǔn)備6張與膠同樣大小的濾紙和1張硝酸纖維素膜(NC)膜，NC膜與濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，至完全浸透。蓋上儀器，接通電源，轉(zhuǎn)膜300 mA恒定電流，LC3B約35 min，β-actin約60 min。轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出放入1×磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中洗1次。5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫放置60 min，4℃過(guò)夜，次日室溫放置30 min。加入抗LC3 抗體(1∶600)及抗內(nèi)參照 β-actin抗體(1∶5 000)，洗3次，每次15 min。加入稀釋HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h，洗膜3 次，每次10 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X膠片曝光15 min；顯影沖洗。

1.8透射電鏡檢測(cè)谷氨酸誘導(dǎo)后 ICCs 的自噬體和超微結(jié)構(gòu)的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠結(jié)腸ICC細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化離心后計(jì)數(shù)接種至6孔板中，每孔接種1×106的細(xì)胞量，貼壁24 h后，加入中濃度谷氨酸與ICCs作用3 h后，經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌3次，每次3 min。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集離心去上清，細(xì)胞固定到2.5%戊二醛6～12 h，把固定液棄掉，細(xì)胞放入PBS緩沖液中，入1%鋨酸后固定1～2 h；乙醇逐級(jí)脫水，純環(huán)氧樹(shù)脂包埋后入40℃烤箱烘烤12 h，取出包埋塊修塊后超薄切片；銅網(wǎng)撈片，電子染色(鉛、鈾染色)；日立7700型透射電鏡觀察和攝圖。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1免疫熒光鑒定大鼠結(jié)腸ICC細(xì)胞 如圖1所示，普通顯微鏡和熒光顯微鏡下大鼠結(jié)腸ICC細(xì)胞胞體呈菱形或三角形，細(xì)胞核大，核周胞質(zhì)較少，細(xì)胞胞體以 2 個(gè)以上長(zhǎng)突起為多見(jiàn)，突起間相互連接并與周圍細(xì)胞緊密相連(圖1A)；熒光顯微鏡下 c-Kit 蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，胞體明顯著色，呈綠色陽(yáng)性顯色(圖1B～1D)；核染信號(hào)圖(圖1E)顯示藍(lán)色為核染信號(hào)。

A：ICC細(xì)胞倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×40)；B：ICC細(xì)胞免疫熒光下c-Kit染色(×100)；C：DAPI染色(×100)；D：c-Kit染色(×400)；E：DAPI染色(×400)；F：融合染色(×400)

2.2不同時(shí)間不同濃度谷氨酸對(duì)結(jié)腸ICC活性的影響 培養(yǎng)3 h時(shí)，各組ICC細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)6 h時(shí)，谷氨酸B、C組ICC細(xì)胞活力顯著低于空白組(P<0.05)；培養(yǎng)6 h時(shí)，谷氨酸A、B、C組ICC細(xì)胞活力均顯著低于空白組(P<0.05，P<0.01);5.0 mmol/L谷氨酸培養(yǎng)細(xì)胞24 h時(shí)，細(xì)胞活力最低，細(xì)胞抑制率最高。見(jiàn)表1。

表1 各組培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)大鼠結(jié)腸 ICC細(xì)胞活力的影響及細(xì)胞抑制率比較

2.3不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度谷氨酸對(duì)ICC的LC3蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，培養(yǎng)6 h時(shí)谷氨酸B組和培養(yǎng)24 h時(shí)谷氨酸B、C組均可顯著提高自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(P<0.05,P<0.01)；與6 h比較，24 h谷氨酸B組、C組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)，提示隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞自噬活性相對(duì)升高，見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度谷氨酸LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較

1～4：空白組、谷氨酸A組、谷氨酸B組、谷氨酸C組

2.4結(jié)腸ICC細(xì)胞內(nèi)自噬體和超微結(jié)構(gòu)的變化 如圖3所示，空白組結(jié)腸ICC內(nèi)可見(jiàn)豐富的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，未見(jiàn)明顯的自噬體或自噬溶酶體；谷氨酸B組細(xì)胞器減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔擴(kuò)張，粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒明顯，可見(jiàn)明顯自噬泡(紅色箭頭為初始自噬泡，藍(lán)色箭頭為降解自噬泡)和大量自噬體。

圖3 透射電鏡下Cajal細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)(×400)

3 討 論

谷氨酸在介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和多種蛋白質(zhì)合成過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，過(guò)量的谷氨酸因其毒性驟增引起氧化應(yīng)激的損傷誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生程序性死亡〔9〕。研究表明間質(zhì)細(xì)胞的丟失與腸道運(yùn)動(dòng)障礙有關(guān)，在胃腸動(dòng)力障礙的結(jié)腸炎模型大鼠 ICC 中出現(xiàn)過(guò)度自噬現(xiàn)象〔10〕?；谏鲜鲆罁?jù)，本研究應(yīng)用過(guò)量的谷氨酸模擬外界不良應(yīng)激誘導(dǎo)離體結(jié)腸ICCs 產(chǎn)生自噬從而構(gòu)建大鼠結(jié)腸ICC自噬模型。

本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的谷氨酸作用于體外培養(yǎng)的 SD 大鼠結(jié)腸ICC，CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度谷氨酸均可降低結(jié)腸ICC的活力，且以24 h時(shí)5 mmol/L谷氨酸效果最優(yōu)。為繼續(xù)驗(yàn)證谷氨酸在此濃度及時(shí)間下的作用效果，通過(guò)Western印跡和透射電鏡觀察，顯示谷氨酸C2組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值最高，透射電鏡出現(xiàn)明顯的自噬泡，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，細(xì)胞器減少，與周圍神經(jīng)突觸關(guān)系網(wǎng)接觸消失，超微結(jié)構(gòu)中的線粒體受損，提示本實(shí)驗(yàn)成功誘導(dǎo)結(jié)腸ICC的自噬。自噬過(guò)程是由一系列自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)完成的，LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，其存在有兩種形式即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，通過(guò) LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值可反映自噬水平，作為評(píng)估細(xì)胞自噬強(qiáng)弱的重要依據(jù)〔11〕。與本研究不同，譚人千等〔12〕通過(guò)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值結(jié)合免疫熒光和透射電鏡技術(shù)成功篩選到谷氨酸誘導(dǎo)大鼠胃 ICCs 自噬的最佳作用濃度和時(shí)間分別為5 mmol/L和 3 h。這可能由于機(jī)體不同位置的ICC有不同特性：發(fā)生應(yīng)激性反應(yīng)初期，產(chǎn)生受損的亞細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊蛋白等較少，隨著時(shí)間的推移ICC自噬活性逐漸增加有關(guān)。

綜上，谷氨酸可以誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸ICC自噬，其最佳作用濃度和刺激時(shí)間分別為 5 mmol/L 和 24 h，為進(jìn)一步研究結(jié)腸ICC功能狀態(tài)，在增殖、凋亡、表型轉(zhuǎn)化和自噬相關(guān)通路的mRNA和蛋白研究提供可靠的細(xì)胞模型，利于今后進(jìn)一步篩選腸道藥物靶點(diǎn)。