張雙 鄧華江 張麗云 鄧家琦 葛紅飛 梁雪梅

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 1老年病科，四川 瀘州 646000；2神經(jīng)外科；3健康管理中心；4超聲科；5陸軍軍醫(yī)大學西南醫(yī)院神經(jīng)外科)

神經(jīng)功能缺損不僅是腦梗死患者的常見癥狀，也是造成罹患腦梗死群體致殘率與病死率高的主要原因，因此早期預測與干預對改善神經(jīng)細胞功能、改善神經(jīng)功能缺損尤為重要〔1，2〕。動脈粥樣硬化是造成個體罹患腦梗死的重要原因，而免疫反應與炎癥反應在動脈硬化斑塊形成過程中的作用不容小覷〔3〕。調節(jié)性T細胞屬于成熟T淋巴細胞亞群，是腦梗死后腦損傷的重要保護調節(jié)器，在免疫性疾病發(fā)生、確保機體免疫耐受能力方面意義重大，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Treg)屬于免疫調控細胞，是目前免疫機制相關指標的研究熱點〔4〕。相關研究顯示，調節(jié)性T細胞對抗腦梗死免疫損傷過程中具有重要意義〔5〕。本研究擬分析腦梗死大鼠建模成功后不同時期CD4+CD25+Treg及神經(jīng)功能情況及其相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇清潔級雄性大鼠60只，周齡5～8 w，平均(6.72±0.76)w；體重0.20～0.28 kg，平均(0.24±0.02)kg。試劑制備：①4.0%多聚甲醛溶液：13.6 g磷酸二氫鉀+3.2 g氫氧化鈉+40 g多聚甲醛混勻，加水至1 000 ml，并將pH值調至7.2～7.4，并過濾上述溶液待用。②檸檬酸緩沖液：0.4 g檸檬酸+3.0 g檸檬酸三鈉混勻，加水至1 000 ml，并將pH值調至6.0，并過濾上述溶液待用。③磷酸鹽緩沖液：0.2 g氯化鉀+8.0 g氯化鈉+0.4g磷酸氫鉀混勻，加水至1 000 ml，并將pH值調至7.35～7.45，并過濾上述溶液待用。線栓制備與處理：1.2號棕色的單尼龍魚線，直徑0.181 mm，將其修剪為22 mm長，30根備用，魚線兩端用燒灼發(fā)將其制備成圓鈍形，頭端直徑0.22～0.24 mm，75%酒精浸泡24 h用生理鹽水滅菌備用。

1.2儀器與設備 高速離心機：Thermo公司，BACTEC 9128全自動培養(yǎng)儀：美國R&D公司，Leica切片機：德國Leica公司，甲醛：湖南化工廠，Tap酶：大連寶生物工程有限公司；大鼠轉化生長因子(TGF)-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(96T)：美國R&D公司，貨號891126。CD4-FITC、CD25-Percp、IgG2ak-PE、IgGlk-Percp、Foxp3-PE：美國eBoiscience公司，破膜液：博士德生物技術有限公司，流式細胞儀：美國貝克曼庫爾特公司。

1.3建立大鼠模型與分組 (1)分組：60只雄性大鼠適應性飼養(yǎng)1 w后，選擇30只作為假手術組，另30只建立大腦中動脈閉塞(MCAO)模型。(2)建立MCAO模型：依據(jù)Zea-Longa線栓法〔6〕建立MCAO模型，具體方法：大鼠禁食水12 h，350 mg/kg 10%水合氯醛(腹腔注射)，直至大鼠對疼痛刺激無反應，并將大鼠背部固定在手術板上，局部消毒、備皮，切口：頸部正中稍偏左，2.0～2.5 cm，分離雙側甲狀腺，暴露左側三角區(qū)(胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌之間)，將左側頸總與頸外動脈鈍性分離，并結扎頸外動脈，小動脈夾閉頸總動脈分叉與近心端，用一次性針頭在近心端處扎一小孔，用預先處理好的魚線從頸外動脈處插入，利用魚線與8-0單尼龍絲線結扎入孔處，結扎松緊適宜，松開動脈夾，利用微動脈夾夾住翼腭動脈，并向頸內動脈緩慢送入18～20 mm阻力感明顯時停止并松開微小動脈夾，將線尾端減掉，清洗并逐層縫合組織與皮膚。術畢幫助大鼠側臥位，保暖，并保持呼吸道通暢。(3)制模成功：術畢清醒后，根據(jù)Zausinger六分法〔7〕評估大鼠神經(jīng)功能：0分：無法自發(fā)行走；1分：自由行走時向健側旋轉；2分：抓住尾巴，大鼠向健側旋轉；3分：向大鼠病灶對側施加壓力，大鼠抵抗力明顯下降；4分：大鼠健側前爪無法伸直；5分：無神經(jīng)功能缺損癥狀。Zausinger評分為1～4分為建模成功，5分為建模失敗，本研究中建模大鼠評分均為0～4分，均建模成功。分別于建模成功后12、24、72 h后處死大鼠，每次10只，所有大鼠給予人性化處死，本研究中全部大鼠的處理均依據(jù)《關于善待實驗動物指導性意見》〔8〕中意見。

1.4指標監(jiān)測與方法 大鼠麻醉后心臟取血，向檢測管與對照管中逐次加入CD4-FITC 1 μl、CD25-Percp和IgGlk-Percp 0.5 μl，加入0.5 ml破膜液后在4℃冰箱中孵育45 min，再次加入2 ml破膜液，加入IgG2ak-PE與Foxp3-PE洗滌1次，再次加入1%多聚甲醛重懸0.5 ml，觀察CD4+CD25+Treg情況。所有操作由專業(yè)人員在嚴格指導下完成。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、雙變量Pearson直線相關性檢驗。

2 結 果

2.1腦梗死大鼠建模成功12、24、72 h CD4+CD25+Treg與神經(jīng)功能情況 與假手術組相比，模型組建模成功12、24、72 h后神經(jīng)功能得分顯著降低(P<0.05)；24、72 h CD4+CD25+Treg顯著降低(P<0.001)。見表1。

表1 腦梗死大鼠建模成功12、24、72 h CD4+CD25+Treg與神經(jīng)功能情況比較

2.2腦梗死大鼠CD4+CD25+Treg與神經(jīng)功能變化的相關性 腦梗死大鼠CD4+CD25+Treg與神經(jīng)功能(Zausinger評分)呈正相關(r=0.593，P=0.001)，見圖1。

圖1 腦梗死大鼠CD4+CD25+Treg表達與神經(jīng)功能相關性

3 討 論

免疫反應在動脈硬化斑塊的形成與進展中具有重大意義，而動脈粥樣硬化又是導致個體罹患腦梗死的重要病理基礎，伴隨腦梗死病理機制的不斷深入研究，免疫機制有望成為治療腦梗死疾病的重要切入點〔9〕。線栓法建立腦梗死大鼠模型，是利用線栓阻斷動脈血管的血液循環(huán)，可真實反映腦梗死的發(fā)病進展，在腦梗死動物實驗模型中應用廣泛〔10〕。

CD4+CD25+Treg屬于免疫調控細胞，主要通過釋放白細胞介素細胞10、TGF-β來達到調控T細胞與細胞因子平衡的目的〔11〕。個體罹患急性腦梗死疾病后，機體內大量炎癥物質造成自身免疫系統(tǒng)紊亂，免疫T細胞活性被削弱，導致機體免疫耐受力下降，氧自由基水平不斷增加，線粒體細胞被不斷殺滅，血管內皮功能遭受損害并不斷加重，機體過氧化反應不斷加重，直接造成CD4+CD25+Treg水平不斷降低，而CD4+CD25+Treg不斷下降又反作用于疾病本身，導致腦梗死病情不斷加重，如此形成負性循環(huán)；再者，CD4+T細胞不斷分化Th1細胞，血清中Th1細胞表達水平不斷升高，機體出現(xiàn)免疫過表達狀態(tài)，限制了CD4+CD25+Treg生成，繼而促進炎癥因子參與動脈斑塊形成、性質改變及神經(jīng)功能損害過程〔12～14〕。本研究結果表明，CD4+CD25+Treg在腦梗死疾病進展中具有重要意義，提示CD4+CD25+Treg在控制疾病進展過程的重要性。腦梗死由于梗死病灶阻斷神經(jīng)組織供血，導致阻斷的神經(jīng)出現(xiàn)損傷，若在有限的時間窗內梗死的病灶無法順利再通，將直接造成神經(jīng)損害程度不斷加重，機體極易產(chǎn)生永久性神經(jīng)功能損害〔15，16〕。本研究結果表明神經(jīng)功能損傷伴隨著腦梗死的進展過程。鑒于上述原因，考慮腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損是否與CD4+CD25+Treg存在某種聯(lián)系。

為進一步探究腦梗死大鼠CD4+CD25+Treg與神經(jīng)功能變化之間的關系，本研究結果顯示，隨著大鼠CD4+CD25+Treg不斷降低，腦梗死大鼠神經(jīng)功能不斷下降。分析其原因可能為：腦梗死發(fā)生后，因疾病原因造成局部組織缺血缺氧性損害，大量炎癥細胞因此分泌并浸潤至組織中，炎癥細胞分泌諸多炎癥因子，導致神經(jīng)功能損害不斷加重〔17，18〕。由此可考慮將CD4+CD25+Treg動態(tài)表達情況作為預測腦梗死個體神經(jīng)功能情況的指標，但其預測機制在本研究中并未體現(xiàn)，仍需要未來進一步分析研究。

綜上，腦梗死大鼠梗死早期CD4+CD25+Treg未見明顯改變，隨著梗死時間延長，大鼠CD4+CD25+Treg逐漸降低，神經(jīng)功能損傷程度加重，二者間存在相關性，考慮早期通過檢測腦梗死CD4+CD25+Treg對預測神經(jīng)功能、指導治療有積極意義。