魏建行 梁荃 黃仕瓊 李利華

(大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科，云南 大理 671000)

心血管疾病導(dǎo)致的死亡約占中國人口死亡的40%以上，而高血壓是心血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素，約有43%的心血管疾病發(fā)病可歸因于高血壓〔1，2〕。動(dòng)脈硬化是高血壓的發(fā)病基礎(chǔ)，是與年齡相關(guān)的病理生理學(xué)過程，可以影響整個(gè)心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)?？顾ダ弦蜃?Klotho)是Kuro-O等〔3〕發(fā)現(xiàn)的一種抗衰老蛋白，主要表達(dá)于腎遠(yuǎn)曲小管和大腦脈絡(luò)膜中。隨著年齡增加，Klotho表達(dá)減少。Klotho基因敲除小鼠可出現(xiàn)多種與衰老相關(guān)的疾病，如動(dòng)脈硬化、不育、皮膚萎縮、骨質(zhì)疏松及肺氣腫等〔3，4〕；而Klotho過表達(dá)則可通過胰島素/胰島素樣生長因子(IGF)1途徑延長壽命〔5〕。Klotho隨著年齡增加表達(dá)減少可能在動(dòng)脈硬化及高血壓、腎臟疾病等發(fā)病中起重要作用〔6～9〕。然而，Klotho表達(dá)減少加速年齡相關(guān)的動(dòng)脈硬化的機(jī)制尚不完全清楚。動(dòng)脈鈣化主要發(fā)生在中膜，在老年人中非常普遍，動(dòng)脈鈣化可加重動(dòng)脈硬化，使動(dòng)脈彈性下降。本研究通過用慢病毒體外干擾人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HA-VSMC)中Klotho的表達(dá)，旨在探討Klotho表達(dá)降低對(duì)細(xì)胞鈣化和表型轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 HA-VSMC購于北納生物公司，慢病毒購于上海吉瑪基因，PCR引物購于上海生工生物工程有限公司，Klotho抗體購于Abcam，骨橋蛋白(OPN)購于Elabscience公司，鈣離子檢測(cè)試劑購于Elabscience公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染 用含有15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HA-VSMC。用慢病毒shRNA干擾Klotho的表達(dá)。Klotho-2073 shRNA(shKlotho-2073)靶點(diǎn)序列為5′-GAGCCGTATACAAGGAATATG-3′；Klotho-1021 shRNA(shKlotho-1021)靶點(diǎn)序列為5′-CCGAGAGCATGAAGAATAACC-3′；Klotho-1207 shRNA(shKlotho-1207)靶點(diǎn)序列為5′-GGATTGACCTTGAATTTAACC-3′；陰性對(duì)照shRNA-NC(shNC組)靶點(diǎn)序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。以3×105個(gè)/孔鋪板細(xì)胞，慢病毒同時(shí)加入1 μg/ml的聚丁二烯72 h后，篩選出最適感染復(fù)數(shù)(MOI)=20時(shí)干擾效率最強(qiáng)，病毒液用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Realtime PCR 提取RNA，測(cè)定濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行Realtime PCR擴(kuò)增，并檢測(cè)Klotho、OPN、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)、平滑肌(SM)22α mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以2-ΔΔCt值表示?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 引物序列

1.2.3Western印跡檢測(cè)Klotho蛋白的表達(dá) 使用慢病毒轉(zhuǎn)染HA-VSMC 72 h后，提取并測(cè)定總蛋白濃度，進(jìn)行凝膠電泳分離，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在5%脫脂牛奶封閉液中室溫?fù)u床上封閉1 h后，加入抗微管蛋白(1∶500)、Klotho(1∶1 000)一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次(15 min/次)后，加入相應(yīng)二抗(1∶10 000)，搖床室溫孵育2 h。再TBST洗膜3次(15 min/次)，加入親光辣根過氧化物酶(Pro-light HRP)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影，使用Image-pro plus灰度值分析。以Tubulin為內(nèi)參計(jì)算Klotho蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定人OPN 慢病毒轉(zhuǎn)染HA-VSMC并培養(yǎng)72 h后，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)凍融，致使細(xì)胞破碎，離心并收集上清。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定OPN含量。

1.2.5微量法測(cè)定鈣離子(Ca2+)和堿性磷酸酶(ALP)活性 采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測(cè)，按說明書方法操作。

1.3統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1RNA干擾抑制HA-VSMC Klotho表達(dá) 用慢病毒轉(zhuǎn)染HA-VSMC 72 h后，熒光顯微鏡和熒光定量PCR證明shKlotho-2073顯著抑制Klotho的表達(dá)，抑制效率為86.4%。見表1、圖1。

表1 不同shRNA 的 Klotho 干擾效率比較

圖1 熒光顯微鏡下觀察不同shRNA對(duì)HA-VSMC的干擾效果(×100)

因此，選擇shKlotho-2073作為干擾載體。通過Western印跡進(jìn)一步證實(shí)Klotho蛋白表達(dá)被顯著抑制〔shNC(0.446±0.025)vs shKlotho(0.303±0.025);P<0.05〕。見圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)Klotho蛋白表達(dá)

2.2HA-VSMC表型轉(zhuǎn)化 shKlotho干擾后α-SMA和SM22α相對(duì)表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)。OPN mRNA及蛋白水平也顯著增加(P<0.05)。見表2。

2.3HA-VSMC鈣化檢測(cè) 相對(duì)于shNC組，shKlotho干擾后細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平明顯增加，ALP活性明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 shKlotho干擾后SM22α、α-SMA、OPEN mRNA、OPEN蛋白、Ca2+及ALP比較

3 討 論

在分子水平，與年齡相關(guān)的動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)變化特征包括血管平滑肌細(xì)胞的成骨轉(zhuǎn)化及收縮表型的喪失，成骨細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(如Runx2)的上調(diào)，骨細(xì)胞標(biāo)志物(ALP、OPN、骨鈣素)釋放增加，細(xì)胞凋亡增加及細(xì)胞外基質(zhì)降解等〔10，11〕。上述的這些持續(xù)改變是血管鈣化、動(dòng)脈硬化和動(dòng)脈血管重構(gòu)的基礎(chǔ)。血管鈣化和動(dòng)脈僵硬增加是血管衰老的標(biāo)志，甚至已被作為衡量心血管年齡的指標(biāo)〔12〕。最近研究表明，Klotho的缺失主要參與動(dòng)脈中膜鈣化的發(fā)展。Hu等〔13〕研究結(jié)果顯示，與野生型慢性腎臟病(CKD)小鼠相比，過表達(dá)Klotho的CKD小鼠可降低血管鈣化的發(fā)生發(fā)展。然而，患有CKD的小鼠Klotho基因缺陷可發(fā)展為嚴(yán)重鈣化和腎功能進(jìn)一步惡化〔16〕。少數(shù)臨床研究也提示Klotho水平降低是維持性血透患者主動(dòng)脈鈣化的危險(xiǎn)因素〔14，15〕。Lim等〔13〕最早發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞中存在內(nèi)源性Klotho表達(dá)。血管平滑肌細(xì)胞中Klotho低表達(dá)可消除成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)23介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并加速血管平滑肌細(xì)胞鈣化的發(fā)展〔13〕。本研究通過RNA干擾技術(shù)，證實(shí)在HA-VSMC中Klotho低表達(dá)可通過促進(jìn)ALP活性，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，加重細(xì)胞鈣化和細(xì)胞表型從收縮型向分泌型轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果有助于深入了解衰老或其他危險(xiǎn)因素導(dǎo)致Klotho表達(dá)減少導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的機(jī)制。

血管平滑肌細(xì)胞存在收縮型和分泌型。在正常情況下，血管平滑肌細(xì)胞通過收縮表型維持主動(dòng)脈壁的彈性，當(dāng)受到生化信號(hào)或機(jī)械刺激時(shí)轉(zhuǎn)化為分泌型，致使動(dòng)脈彈性下降，主動(dòng)脈壁僵硬。血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化也是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，尤其是在高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病和介入后再狹窄等心血管疾病的發(fā)病中具有重要作用〔17〕。當(dāng)血管受損或生長因子刺激體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞通過改變基因的表達(dá)，由收縮表型轉(zhuǎn)化為分泌型〔18〕。Lim等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞中Klotho缺乏會(huì)導(dǎo)致收縮表型的喪失。因此，血管平滑肌細(xì)胞從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛团cKlotho缺乏有關(guān)，且進(jìn)一步研究表明內(nèi)源性Klotho表達(dá)僅存在于具有收縮表型的血管平滑肌細(xì)胞中。血管平滑肌細(xì)胞從收縮型向分泌型轉(zhuǎn)化的過程由心肌素(Myocardin)協(xié)助，它是轉(zhuǎn)錄因子SRF的輔助因子，結(jié)合于CArG-box序列，調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞收縮基因的轉(zhuǎn)錄，包括α-SMA/SM22α〔19〕。本研究結(jié)果進(jìn)一步提供了抗衰因子Klotho表達(dá)減少參與細(xì)胞鈣化及表型轉(zhuǎn)化的證據(jù)，具有重要的科學(xué)意義。

總之，人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞Klotho表達(dá)減少可促進(jìn)細(xì)胞鈣化和表型轉(zhuǎn)化，可能在動(dòng)脈鈣化中發(fā)揮重要作用?？顾ダ弦蜃覭lotho可作為防治動(dòng)脈硬化的一個(gè)新的干預(yù)靶點(diǎn)。