王清 李響 張殿文 吳迪 劉寧 李偉

(1吉林省中醫(yī)藥科學院，吉林 長春 130012；2吉林大學基礎醫(yī)學院)

癲癇是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的,以短暫腦功能失常為特征的慢性腦部疾病,是目前神經(jīng)科內(nèi)僅次于腦血管病的第二大疾病，發(fā)病率接近1%，全球有5 000萬例癲癇患者。我國人口癲癇終生患病率在4‰～7‰,各地癲癇患病率差異較大，在0.48‰～8.51‰。上海金山區(qū)調(diào)查顯示:癲癇患病率為3.62‰，2012 年湖南岳陽調(diào)查癲癇終身患病率為4.5‰。據(jù)此估計，我國約有900萬例癲癇患者，同時每年有40萬例新發(fā)癲癇患者〔1〕。WHO已將癲癇列為重點防治的神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病之一。目前，癲癇的治療主要依靠藥物，臨床常用抗癲癇藥均為進口或仿制藥，價格昂貴且多伴有患者不能耐受的副作用，如神經(jīng)毒性損害引起的嚴重惡心、嘔吐等及特異性損害如肝毒性、致畸性、骨髓抑制等。因此，臨床迫切需要尋找新一代高效、低毒、普惠的抗癲癇新藥。近年來，國內(nèi)外同行一直致力于尋找新一代抗癲癇新藥，但至今尚未取得令人滿意的結果，國內(nèi)尚無抗癲癇新藥上市。

6-(4-氯苯氧基)四唑并〔5,1-a〕酞嗪(Q808)是以喹啉并三唑為先導化合物，通過結構修飾合成超過1 000個結構新穎具有潛在抗癲癇活性化合物，按照美國國立衛(wèi)生院(NIH)推薦的抗癲癇藥研究標準〔2，3〕，經(jīng)過篩選、優(yōu)化、早期評價等階段的研究，歷經(jīng)15年時間最終從多個先導化合物中優(yōu)化出1個新化合物Q808，其與現(xiàn)有的抗癲癇藥物結構完全不同，是一種全新結構的化合物。本文分析Q808抗鼠癲癇活性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 Q808(吉林英聯(lián)生物制藥股份有限公司，批號：20140502)；托吡酯片(西安楊森制藥有限公司，批號：131216725)；苯妥英鈉片(天津力生制藥有限公司，批號：1302005)；丙戊酸鈉片(湖南湘中制藥有限公司，批號：131112)。戊四唑(PTZ，批號：1401097)；3-巰基丙酸(3-MP，批號：32755，上海晶純生化科技股份有限公司)；谷氨酸(Glu)標準品(批號：10K0129)、谷氨酰胺(Gln)標準品(批號：077K1821)、腦內(nèi)γ氨基丁酸(GABA)標準品(批號：083K0024，Sigma)。

1.2動物 KM小鼠，體重19～21 g，雌雄各半，購自長春生物制品研究所有限責任公司〔合格證號：SCXK(吉)2011-0003〕；Wistar大鼠，體重120～140 g，雌雄各半，購自長春億斯實驗動物技術有限責任公司〔合格證號：SCXK(吉)2011-0004〕。動物在明/暗各12 h的飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)，自由攝食水。

1.3儀器 JTC-1型驚厥及痛覺實驗交流刺激器(成都儀器廠)；高效液相色譜庫侖電化學分析系統(tǒng)(ESA,Chelmsford,MA,USA)；全細胞膜片鉗(HEKA EPC10,HEKA Instruments,New York,USA)；振動切片機(LEICA VT1000 S,LEICA,Germany)。

1.4對最大電休克發(fā)作(MES)癲癇模型量效-時效關系的影響 采用MES法〔4～6〕，實驗前24 h采用刺激參數(shù)：小鼠刺激強度110 V，刺激時間0.2 s進行篩選。大鼠刺激強度100 V，刺激時間0.5 s進行篩選。以出現(xiàn)后肢強直性伸直為MES驚厥指標，凡刺激后未見后肢強直或反應不明顯者棄之不用。合格小鼠70只隨機等分為7組，分別為模型對照組、托吡酯片25 mg/kg、苯妥英鈉40 mg/kg、丙戊酸鈉150 mg/kg、Q808高劑量80 mg/kg、Q808中劑量40 mg/kg、Q808低劑量20 mg/kg。灌胃給藥1次，體積均為20 ml/kg，模型對照組給予同體積0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。于給藥后1、2、3、4、6、8、10、12、24 h各刺激1次。合格大鼠70只隨機等分為7組，分別為模型對照組、托吡酯片20 mg/kg、丙戊酸鈉100 mg/kg、苯妥英鈉35 mg/kg、Q808高劑量60 mg/kg、Q808中劑量30 mg/kg、Q808低劑量15 mg/kg。灌胃給藥1次，體積均為20 ml/kg，模型對照組給予同體積0.5%CMC-Na。于給藥后1、2、4、6、8、10、12 h各刺激1次。以出現(xiàn)后肢強直性驚厥為觀察指標，計算驚厥率。

1.5對化學物質(zhì)誘發(fā)驚厥的影響

1.5.1對PTZ所致小鼠驚厥的影響 參照文獻方法〔4～6〕，分組與給藥方式同1.4。于給藥后2 h，小鼠均腹腔注射PTZ 100 mg/kg誘發(fā)驚厥模型，體積為10 ml/kg，觀察30 min。以全身陣攣性驚厥為觀察指標，記錄驚厥潛伏期、強直率、死亡率及發(fā)作級別，若驚厥潛伏期超過30 min則按30 min計算。

1.5.2對3-MP所致小鼠驚厥的影響 參照文獻方法〔4～6〕，分組及給藥同1.4。于藥后2 h，每鼠均皮下注射3-MP 60 mg/kg誘發(fā)驚厥模型，體積為10 ml/kg，觀察30 min。觀察指標與計算方法同1.5.1。

1.6對腦內(nèi)GABA等神經(jīng)遞質(zhì)的影響 取雄性大鼠20只，隨機分為4組，分別為溶劑組0.5%CMC-Na、Q808高劑量 60 mg/kg、Q808中劑量30 mg/kg、Q808 低劑量15 mg/kg組。灌胃給藥1次，體積均為20 ml/kg。于藥后2 h斷頭取腦，并分區(qū)前額葉皮層、海馬和丘腦組織。腦樣本進一步加0.1 mol/L HClO4適量(1 mg：10 μl)，勻漿，離心15 000 r/min 30 min 4 ℃。取上清液，離心15 000 r/min 15 min。取上清0.22 μmol/L濾膜過濾(冰上操作)。

采用高級液相色譜(HPLC)電化學檢測器測定GABA、Glu、Gln含量。分析柱：3 μmol/L,3×50 mm Capcell Pak MGC18 column from Shiseido(Tokyo,Japan)。衍生劑：避光 27 mg 鄰苯二甲醛溶于1 ml甲醇，完全溶解后加10 mg硫基乙醇和9 ml 0.1 mol/ml四硼酸鈉(需過濾)，搖勻后為5×溶液，放于4℃冰箱保存。臨用前用0.1 mol/ml四硼酸鈉溶液稀釋為1×溶液。流動相:A：288 ml乙腈+512 ml甲醇+1 200 ml 0.1 mol/L Na2HPO4水溶液，含有機相比例為40%；B：36 ml乙腈+64 ml甲醇+1 900 ml 0.1 mol/L Na2HPO4水溶液，含有機相比例為5%；流動相梯度：0.00 min 100% B相，流速為0.7 ml/min；10.00 min 90% B相；20.00 min 40% B相；30.00 min 0% B相；35.00 min 0% B相；36.00 min 100% B相；41.00 min 100% B相，結束。電極電勢為：+250 mV、+280 mV和+500 mV；柱溫：T = 38℃。分析軟件：CoulArray(ESA,Chelmsford,MA,USA)。

1.7對自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)和抑制性突觸后電流(sIPSC)的影響 取雄性大鼠15只分為兩組，sEPSC 6只，sIPSC 9只。采用全細胞膜片鉗記錄，觀察Q808 10-5mol/L對海馬CA1區(qū)椎體細胞的sEPSC及sIPSC作用。

1.8對GABA所介導電流的影響 Q808對原代培養(yǎng)神經(jīng)元的GABA電流作用評價〔7～9〕：將種有成熟的大鼠原代神經(jīng)元玻片放置在細胞記錄外液中，控制溫度為25℃，電極記錄內(nèi)液為細胞內(nèi)液，利用電壓鉗模式記錄全細胞狀態(tài)下的膜電流，外置噴藥管給50 μmol/L的GABA，記錄外源性GABA刺激誘發(fā)的GABA受體電流，GABA兩次刺激間間隔1 min，直到記錄到兩次穩(wěn)定電流信號為止，之后給予50 μmol/L的GABA和10 μmol/L Q808的混合液，方法同1.7，記錄給予Q808條件下的GABA電流。比較給藥和對照狀態(tài)下GABA電流的幅值，衰減時間等電流特性。

1.9數(shù)據(jù)處理 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗，秩和檢驗；采用ANOVA判斷總體顯著性差異。

2 結 果

2.1對MES量效-時效關系的影響 Q808于小鼠給藥后1～2 h即具有明顯的抗電休克作用，可持續(xù)12 h，且其作用強度、起效時間與劑量有一定依賴性；苯妥英鈉可持續(xù)作用24 h，而托吡酯和丙戊酸鈉僅維持作用3 h。Q808大劑量于大鼠給藥后1 h，中小劑量于給藥后4 h即具有明顯的抗電休克作用，可持續(xù)作用12 h；作用強度與托吡酯相近，作用時間長于苯妥英鈉，而丙戊酸鈉則無明顯作用，見表1。

表1 各組給藥后不同時間驚厥率(n=10，%)

2.2對PTZ、3-MP所致小鼠驚厥的影響 與模型對照組比較，Q808各劑量能明顯延長PTZ誘發(fā)驚厥鼠的驚厥潛伏期，顯著降低驚厥鼠的強直率、死亡率及發(fā)作級別(P<0.05)。與模型對照組比較，Q808各劑量能顯著降低3-MP誘發(fā)驚厥鼠的強直率、死亡率，明顯延長驚厥潛伏期(P<0.05)，但對癲癇發(fā)作級別無影響；作用強于托吡酯和丙戊酸鈉，與苯妥英鈉相近，見表2。

表2 各組PTZ、3-MP所致小鼠驚厥情況

2.3對GABA等神經(jīng)遞質(zhì)的影響 Q808 大劑量和中劑量能提高腦內(nèi)海馬腦區(qū)的GABA含量，Q808 大劑量降低了丘腦Glu、Gln含量，但對皮層各遞質(zhì)含量無明顯影響。見表3。

表3 各組腦內(nèi)GABA、Glu及Gln含量比較

2.4對sEPSC和sIPSC的影響 Q808可顯著增加sIPSC的頻率，但對sIPSC幅值及sEPSC相關指標沒有明顯影響，見表4。

表4 Q808 10-5 mol/L對sEPSC和sIPSC的影響

2.5對GABA所介導電流的影響 Q808對海馬GABA介導的升電流、降電流及幅值變化無顯著性差異，見表5。

表5 Q808對GABA所介導電流的影響

3 討 論

一般認為MES是臨床癲癇大發(fā)作典型的代表模型(強直-陣攣發(fā)作)，PTZ誘發(fā)驚厥實驗動物模型是臨床癲癇小發(fā)作典型的代表模型，如受試化合物能夠對抗上述兩種動物模型，則其有可能成為臨床上治療癲癇大發(fā)作和小發(fā)作的有效藥物〔4～6〕。sEPSC是Glu受體所介導的自發(fā)性興奮性突觸傳遞〔10，11〕。sIPSC是GABA受體所介導的自發(fā)性抑制性突觸傳遞〔10〕。本實驗結果表明，Q808對小鼠和大鼠MES癲癇模型均具有明顯的抑制活性，于藥后1 h起效，并可持續(xù)作用12 h，且無種屬差異，而臨床常用抗癲癇藥苯妥英鈉、丙戊酸鈉和托吡酯對大、小鼠MES癲癇模型作用強度、作用持續(xù)時間差異較大?；瘜W物質(zhì)PTZ主要作用于腦干嘴側區(qū)及大腦，促使興奮性突觸的易化過程增強，容易引起驚厥；文獻報道〔12〕，PTZ致驚厥發(fā)作可能還與提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞外K+濃度，使細胞膜部分去極化而使其興奮性增高有關。3-MP是GABA合成酶谷氨酸脫羧酶(GAD)的競爭性抑制劑，可抑制GABA的合成，從而降低腦中的GABA含量,從而引起動物驚厥。Q808能顯著降低PTZ、3-MP誘發(fā)驚厥鼠的強直率、死亡率和發(fā)作級別，明顯延長驚厥潛伏期，表明Q808對MES及化學物質(zhì)誘發(fā)驚厥均具有良好的抗癲癇活性。目前癲癇的發(fā)病機制尚未完全清楚,其病因可能與中樞抑制性GABA能系統(tǒng)和中樞興奮性Glu及天冬氨酸能系統(tǒng)有關，降低GABA突觸功能、直接阻斷GABA受體，或降低GABA介導的氯通道開放都可能誘發(fā)驚厥〔13〕。

本實驗結果表明Q808抗癲癇作用存在腦區(qū)特異性，其作用機制之一可能與提升腦內(nèi)海馬腦區(qū)的GABA能系統(tǒng)和降低丘腦Glu能系統(tǒng)有關。電生理試驗結果提示Q808可能通過提高突觸間GABA釋放頻率發(fā)揮抗癲癇作用；Q808對海馬GABA介導的電流無明顯影響，提示Q808對GABA相關受體功能沒有明顯影響，GABA受體可能不是Q808作用靶點。