余直臻 喻喆 方立萍

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 大連 116023)

腦膠質(zhì)瘤生長迅速，侵襲性、浸潤性強，正常腦組織與腫瘤組織之間界限模糊，外科治療徹底清除病灶組織難度系數(shù)大，且因諸多藥物難以進入血腦屏障，化療藥物長時間使用后會出現(xiàn)耐藥性等因素影響，即使是為患者采用外科手術(shù)聯(lián)合放化療輔助方案，治療效果也不理想，因此開發(fā)高效的治療靶點來提高腦膠質(zhì)瘤的整體化療獲益亟不可待〔1〕。替莫唑胺屬于腦膠質(zhì)瘤治療一線藥物，但患者易對其產(chǎn)生耐藥，影響治療效果，既往研究指出，替莫唑胺的耐藥性與多耐藥蛋白密切相關(guān)〔2〕。而多重耐藥主要表現(xiàn)為多重耐藥相關(guān)分子的表達異常，如P糖蛋白(P-gP)、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)、DNA錯配修復(fù)(MMR)系統(tǒng)等〔3〕。人類mut-s同系物(hMLH)、hMSH2是參與錯配修復(fù)功能的重要基因，hMLH、hMSH2基因的穩(wěn)定性將直接影響細胞的錯配修復(fù)功能，而HOXB9隸屬于HOX基因家族，在諸多惡病質(zhì)如乳腺癌、肺癌等中表達異常，在促進腫瘤病灶生長、侵襲、凋亡等過程中舉足輕重〔4〕。由此考慮腦膠質(zhì)瘤患者在替莫唑胺化療過程中，HOXB9基因表達是否異常，基因的表達情況是否與替莫唑胺化療耐藥存在某種關(guān)聯(lián)。本研究旨在通過觀察腦膠質(zhì)瘤化療患者HOXB9基因與多藥耐藥相關(guān)分子表達情況其上述指標(biāo)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究方法與思路的設(shè)計均嚴(yán)格遵照醫(yī)學(xué)倫理委員相關(guān)規(guī)定，且均在取得患者和(或)監(jiān)護人同意后整理臨床資料?；仡櫺苑治?018年1月至2020年4月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院完成化療且符合條件的腦膠質(zhì)瘤患者的臨床資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)磁共振成像技術(shù)確診為腦膠質(zhì)瘤；②外科術(shù)后均接受替莫唑胺化療；③患者病理組織封存完好；④臨床治療保存完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已經(jīng)出現(xiàn)遠處繼發(fā)性轉(zhuǎn)移；②合并其他部位惡病質(zhì)者；③身體素質(zhì)低下，難以耐受化療者；④心臟、腎等重要臟器失功。最終納入82例腦膠質(zhì)瘤患者，其中男42例，女40例；年齡60～78歲，平均(69.52±2.19)歲；腫瘤類型：星形細胞瘤35例，膠質(zhì)母細胞瘤24例，少枝膠質(zhì)細胞瘤15例，其他8例。腦膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺耐藥性情況分為耐藥組34例，非耐藥組48例。耐藥組男17例，女17例；年齡60～77歲，平均(69.23±2.15)歲；腫瘤類型：星形細胞瘤14例，膠質(zhì)母細胞瘤10例，少枝膠質(zhì)細胞瘤8例，其他2例。非耐藥組男25例，女23例；年齡60～78歲，平均(69.61±2.21)歲；腫瘤類型：星形細胞瘤21例，膠質(zhì)母細胞瘤14例，少枝膠質(zhì)細胞瘤7例，其他6例。兩組基線資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2替莫唑胺化療耐藥判定 替莫唑胺化療患者藥物敏感性分析參照文獻〔5〕中方法進行判定。

1.3儀器與試劑 人惡性腦膠質(zhì)瘤株U251由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所提供；胎牛血清、DMEM由美國Solarbio公司生產(chǎn)，噻唑藍(MTT)試劑盒選自碧云天生物技術(shù)有限公司，Tranawall小室由美國Corning公司生產(chǎn)，兔抗人HOXB9及兔抗人IgG二抗均選自美國Abcam公司，引物的設(shè)計合成由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成，cDNA逆轉(zhuǎn)錄的PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供，熒光定量PCR試劑盒選擇SYBR Premix ExTaqTMⅡ，均由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供，兔抗人MGMT、hMSH2、hMLH多克隆抗體均選自武漢博士德公司，EnVisionTM兔/鼠型染色試劑盒由上?；蚬咎峁?。

1.4標(biāo)本處理 所有標(biāo)本常規(guī)固定、脫水、切片、石蠟包埋、蘇木素染色。上述所有操作嚴(yán)格遵照試劑、儀器、試劑盒說明書進行，且整個操作過程均由專業(yè)人員在嚴(yán)格質(zhì)控下完成。

1.5HOXB9基因〔6〕參照文獻〔7〕中判定方法：選取5個高倍視野(細胞計數(shù)>200)觀察陽性細胞染色強度并計算陽性細胞占比，判定細則為：染色陽性信號為細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，0分無染色，1分淺黃色，2分黃色，3分棕黃色；再按照陽性細胞占比計分：0分為陽性細胞占比<5%，1分為≥5%且<25%，2分為≥25%且<50%，3分為≥50%且<75%，4分為≥75%，兩者相乘為最終積分，并根據(jù)最終得分作為染色程度進行統(tǒng)計學(xué)計算。

1.6P-gP與MGMT結(jié)果判定 參照文獻〔7〕中相關(guān)判定方法，陽性：腦膠質(zhì)瘤細胞膜或胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒且占比10%～30%，強陽性：陽性細胞數(shù)占比≥30%；陰性：陽性細胞數(shù)占比<10%。

1.7hMLH與hMSH2 參照文獻〔8〕中相關(guān)判定方法 隨機選擇切片中10個高倍視野內(nèi)400個腦膠質(zhì)瘤細胞中陽性細胞占比，陽性：腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)可見棕黃色的顆粒，且陽性細胞占比≥25%，陰性：陽性細胞占比<25%。

上述判定結(jié)果均將武漢博士德公司提供的陽性切片作為陽性對照，5%胎牛血清替代一抗視為陰性對照，且本次研究將陽性、強陽性均視為陽性。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進行χ2檢驗、Spearman分析及Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1HOXB9基因與多藥耐藥相關(guān)分子表達 與非耐藥組相比，耐藥組HOXB9、P-gP、MGMT陽性率較高，hMLH、hMSH2陰性率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組HOXB9基因與多藥耐藥相關(guān)分子表達對比〔n(%)〕

2.2HOXB9基因與多藥耐藥因子相關(guān)性分析 HOXB9基因與P-gP、MGMT表達呈正相關(guān)(r=0.815、0.876，均P<0.001)，HOXB9基因與hMLH、hMSH2呈負相關(guān)(r=-0.213、-0.254，均P<0.05)。

2.3HOXB9基因?qū)δX膠質(zhì)瘤患者采取替莫唑胺化療時耐藥的回歸分析 將腦膠質(zhì)瘤患者采取替莫唑胺化療時耐藥情況作為因變量，HOXB9基因作為自變量，經(jīng)Logistic回歸分析證實，HOXB9基因陽性表達可能是腦膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療耐藥的影響因素(OR>1，P<0.001)。見表2。

表2 HOXB9基因?qū)δX膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療耐藥的回歸分析

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤耐藥機制繁冗復(fù)雜，盡管臨床關(guān)于惡病質(zhì)耐藥基因及其產(chǎn)物的研究諸多，但有關(guān)人腦膠質(zhì)瘤患者采取替莫唑胺化療時耐藥基因與腦膠質(zhì)瘤耐藥性的關(guān)系尚未明確。探究耐藥基因與腦膠質(zhì)瘤患者耐藥性之間的關(guān)系，對降低腦膠質(zhì)瘤患者對替莫唑胺的耐藥性，提高臨床化療效果尤為重要。

研究顯示，腦膠質(zhì)瘤患者化療產(chǎn)生耐藥性是由多種因素相互作用的結(jié)果，總結(jié)分析造成腦膠質(zhì)瘤患者對化療產(chǎn)生耐藥性的原因可能有：①化療藥物難以透過血腦屏障；②蓄積在腦膠質(zhì)瘤細胞中的藥物較少；③諸多化療藥物解毒、代謝進程加快；④DNA損傷修復(fù)影響等〔9〕。近期，隨著臨床對腦膠質(zhì)瘤化療耐藥性的研究不斷深入，初步得出HOXB9基因、多耐藥相關(guān)分子的表達產(chǎn)物P-gP、MGMT、hMLH、hMSH2等與腦膠質(zhì)瘤患者化療耐藥性密不可分〔10〕。替莫唑胺富含咪唑四嗪環(huán)，屬于臨床腦膠質(zhì)瘤一線化療藥物，容易透過血腦屏障，致使腦膠質(zhì)瘤細胞DNA烷基化，進而發(fā)揮細胞毒性作用〔11〕。替莫唑胺雖一定程度上改善了患者預(yù)后，但有效率較低，尤其是對復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者的有效性更低，造成這一現(xiàn)象的主要原因主要與腦膠質(zhì)瘤患者對替莫唑胺的耐藥性增加有關(guān)〔12〕。由此可見，探尋逆轉(zhuǎn)耐藥的高效途徑，對提高腦膠質(zhì)瘤患者的化療效果尤為關(guān)鍵。

HOXB9基因隸屬于Hox轉(zhuǎn)錄因子家族，研究表明，Hox家族成員不僅參與胚胎發(fā)育、干細胞自我修復(fù)更新、組織重建等生理過程，與諸多惡病質(zhì)發(fā)生、進展也密不可分，此外還能夠編碼轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因彼此之間的協(xié)同表達〔13〕。劉琪等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，HOXB9基因?qū)儆谀[瘤抑制因子，沉默的HOXB9基因在甲狀腺乳頭狀癌增殖、侵襲中舉足輕重，臨床可將其作為甲狀腺癌的治療新靶點。由此證實，HOXB9基因可為惡病質(zhì)疾病治療提供新思路。

MGMT屬于DNA修復(fù)酶，可幫助染色體躲避烷化劑的損傷，MGMT可有效修復(fù)被烷基化的鳥嘌呤，阻止DNA交鏈形成，從而達到降低化療藥物細胞毒性〔15〕。P-gP在具有分泌與排泄雙重功能的細胞膜上分布，主要生理作用即維持器官正常生理作用、運輸、轉(zhuǎn)化激素、調(diào)節(jié)細胞吞噬、排泄代謝產(chǎn)物、藥物解毒等〔16〕。P-gP屬于能量依賴性藥物輸出泵，不僅存在與抗腫瘤藥物的結(jié)合位點，也含有ATP結(jié)合位點，因此，P-gP一旦結(jié)合某種抗腫瘤藥物，便可通過ATP產(chǎn)生能量，將抗腫瘤藥物泵出病灶細胞，而病灶細胞內(nèi)抗腫瘤藥物濃度變化因此下降，藥物的抗腫瘤作用因此削弱，抗腫瘤藥物的耐藥性因此出現(xiàn)〔17〕。hMLH、hMSH2是參與錯配修復(fù)功能的主要基因，對控制基因突變與維持DNA復(fù)制保真度意義重大，在錯配修復(fù)系統(tǒng)中任意一個基因突變都可造成細胞錯配修復(fù)功能丟失，出現(xiàn)復(fù)制錯誤或不穩(wěn)定〔18〕。本研究結(jié)果表明HOXB9基因的表達情況可能與腦膠質(zhì)瘤患者采取替莫唑胺化療時產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。HOXB9基因陽性表達率高可能是造成腦膠質(zhì)瘤患者采取替莫唑胺化療時產(chǎn)生耐藥性的影響因素。鑒于此，臨床可在腦膠質(zhì)瘤患者開展替莫唑胺化療前，通過對HOXB9基因異常表達進行及時合理干預(yù)，旨在降低腦膠質(zhì)瘤患者開展替莫唑胺化療時的耐藥率。但本研究納入的樣本數(shù)量較少，研究結(jié)論缺乏臨床論據(jù)證實，因此，本研究結(jié)論的可信度還需在未來開展更多的相關(guān)性研究加以驗證，旨在指導(dǎo)臨床腦膠質(zhì)瘤患者的化療。

綜上所述，HOXB9基因與P-gP、MGMT、hMLH、hMSH2諸多耐藥分子之間關(guān)系密切，HOXB9基因可能是造成腦膠質(zhì)瘤患者開展替莫唑胺化療時產(chǎn)生耐藥的危險因素，在開展替莫唑胺化療前，可通過監(jiān)測腦膠質(zhì)瘤患者體內(nèi)HOXB9基因表達情況，針對異常表達者，及時干預(yù)治療，旨在降低腦膠質(zhì)瘤患者開展替莫唑胺化療時的耐藥率。