蔣子賀 尹昌浩 朱曉峰,3

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000;2牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院;3黑龍江省缺血性腦卒中防治重點實驗室)

血管性認(rèn)知障礙(VCI)是腦血管病變及其危險因素導(dǎo)致的臨床腦卒中或亞臨床血管性腦損傷，涉及至少一個認(rèn)知域受損的臨床綜合征，涵蓋了從輕度認(rèn)知障礙到癡呆，也包括合并阿爾茨海默病(AD)等混合性病理所致的不同程度的認(rèn)知障礙。根據(jù)流行病學(xué)研究〔1〕，我國65歲以上的人群中VCI患病率約為8.7%。非癡呆型血管性認(rèn)知障礙(VCIND)為血管性癡呆的早期階段，具有很高的危險性轉(zhuǎn)化為癡呆。對VCIND患者隨訪2年發(fā)現(xiàn)其演變?yōu)榘V呆的比例高達(dá)40%〔2〕。研究〔3〕同樣顯示50%的VCIND患者有可能轉(zhuǎn)化為癡呆。VCIND臨床上主要表現(xiàn)以注意力、執(zhí)行功能的減退及運(yùn)動操作和信息處理速度的減慢為主，其可能與額葉-皮質(zhì)下環(huán)路的阻斷有關(guān)。鑒于VCI一旦進(jìn)入中晚期沒有治療藥物和手段，因此在早期階段的VCIND是VCI治療和預(yù)防的最佳階段。故明確其遺傳易感性及危險因素對于早期預(yù)防血管性癡呆具有重要的臨床意義。正目的簇集素(CLU)基因編碼clusterin，也稱為載脂蛋白J，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最豐富的載脂蛋白之一，可影響Aβ聚集、介導(dǎo)Aβ清除、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、誘發(fā)補(bǔ)體反應(yīng)及神經(jīng)炎癥反應(yīng)。CLU作為高密度脂蛋白膽固醇的組成部分，參與膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，與動脈粥樣硬化(AS)〔4〕有關(guān)。而AS是VCI的最重要病因機(jī)制，基于以上，我們推測CLU基因可能參與VCI的發(fā)生和發(fā)展。本研究采用病例對照方法探討基因位點的多態(tài)性與VCIND的相關(guān)性，明確其在VCI病程進(jìn)展中可能的作用機(jī)制，為VCI的早期預(yù)警生物學(xué)標(biāo)志物及干預(yù)提供重要的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1受試者收集 2018年10月至2019年10月牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院招募右利手VCIND患者42例納入VCIND組，認(rèn)知正常者23例納入認(rèn)知正常組。入組標(biāo)準(zhǔn)(參照“2016中國血管性認(rèn)知障礙診療指導(dǎo)規(guī)范”中VCIND的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕)：①病史：患者知情者有記憶力下降的主訴；②認(rèn)知：至少1項認(rèn)知領(lǐng)域存在損害證據(jù)；③功能：工具性日常生活活功能力量表(IADL)正?；蜉p微受損，不足以影響?yīng)毩⑿?；④血管病證據(jù)：臨床腦卒中史或影像學(xué)證實的腦血管病灶；⑤支持血管性原因的特征：腦血管病是認(rèn)知損害的主要原因。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他可引起認(rèn)知功能障礙的疾病，例如可引起認(rèn)知功能障礙的神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病(如腦腫瘤、帕金森病、腦炎、癲癇等)、腦外傷導(dǎo)致的認(rèn)知障礙；其他可引起認(rèn)知損害的疾病，如甲狀腺功能異常、嚴(yán)重貧血、梅毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、藥物、酒精等；有精神病史者或先天精神發(fā)育遲緩者；排除有嚴(yán)重聽、視力障礙，不能配合完成檢查者。

1.2神經(jīng)心理學(xué)評估 簡易智力狀況檢查表(MMSE)中文版采用張明園修訂版，蒙特利爾認(rèn)知評估(MoCA)中文版采用北京版：評分≤13分(文盲)，14～19分(小學(xué))，20～24分(初中及以上)；MMSE評分≤19分(文盲)，20～22分(小學(xué))，23～26分(初中及以上)。

1.3影像學(xué)評估 使用荷蘭飛利浦公司3.0T TX磁共振儀進(jìn)行影像學(xué)檢查。所有受試者接受T1、T2、彌散加權(quán)成像、液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列及磁敏感加權(quán)成像，以識別各種標(biāo)志性影像學(xué)改變。采用總SVD評分項目〔6〕包括：腔隙性數(shù)量≥1個，CMBs數(shù)量≥1個，EPVS，WMH腦室周圍 Fazekas評分≥3分或深部，上述項目各計1分，各項相加為總SVD評分。

1.4DNA提取方法及檢測 DNA提取收集空腹靜脈血5 ml并置于-80℃冰箱中，分批進(jìn)行DNA的提取，質(zhì)控合格。研究中SNP基因庫信息來自公共數(shù)據(jù)庫NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫，查詢基因CLU標(biāo)準(zhǔn)序列。其序列號為rs11136000及rs9331888位點。采用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計SNPrs11136000及rs9331888位點的KASP引物rsl1136000snp位點Primer Allele FAM引物序列為5′-CCCTGAATCTTACCTTTCTATTGC-3′，Primer Allele HEX引物序列為5′-AAACTCCTGACCCCAAGTAATATG-3′，rs9331 888snp位點Primer_Allele FAM引物序列為5′-CAATTCCCTTCGGAGAGTAGAG-3′，Primer_Allele HEX引物序列為5′-GAAAGGGTCCATTGTGTAAGAC-3′。通過翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司得出PCR產(chǎn)物，樣本純化后高通量測序，測序得到的原始二進(jìn)制basecalling數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina bcl2fastq軟件轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，Illumina RTA軟件進(jìn)行圖像識別和Basecalling，Illumina bcl2fastq 2.17根據(jù)每個樣本的索引信息進(jìn)行拆分混合測序(demultiplexing)并統(tǒng)計產(chǎn)出reads數(shù)和堿基測序質(zhì)量(Q30)。

1.5統(tǒng)計分析 使用SPSS21.0進(jìn)行χ2檢驗、獨立樣本t檢驗評估人口統(tǒng)計學(xué)變量的分類。進(jìn)行Hardy Weinberg平衡定律吻合度測定，采用χ2檢驗、隨機(jī)區(qū)組設(shè)計資料的多因素方差分析進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1人口學(xué)資料及血管性危險因素的比較 兩組在年齡、性別、民族、吸煙、飲酒史、糖尿病、心臟病、同型半胱氨酸水平、血脂水平方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組在高血壓方面比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 人口學(xué)資料及血管性危險因素分析

2.2基因型和等位基因頻率分布 電泳結(jié)果提示，CLU基因認(rèn)識rs11136000snp位點共3種基因型：TT型、TC型、CC型(表2)。兩組TT基因型和T等位基因頻率分布相比，VCIND組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且CLU基因rs11136000位點C基因攜帶者(CC+CT)罹患VCIND的風(fēng)險是非C基因攜帶者(TT)的6.875倍(95%CI為0.820～57.626，P<0.05)。rs9331888snp位點共3種基因型：GG型、GC型、CC型(表3)，兩組基因型與等位基因?qū)Ρ龋瑹o顯著差異(P>0.05)。

表2 rs11136000與VCIND的關(guān)系〔n(%)〕

表3 rs9331888與VCIND的關(guān)系〔n(%)〕

2.3VCIND與SVD評分的相關(guān)性 VCIND組影像學(xué)評分〔(2.12±0.80)分〕明顯高于認(rèn)知正常組〔(1.04±0.825)分〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，提示在VCIND患者中多表現(xiàn)為腔隙性腦梗死、顱內(nèi)微出血、血管間隙、腦白質(zhì)改變等顱內(nèi)結(jié)構(gòu)性變化。在SVD評分亞組中，腔隙性腦梗死、血管間隙、腦白質(zhì)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表4)，提示有腔隙性腦梗死、血管間隙、腦白質(zhì)改變的患者更容易產(chǎn)生認(rèn)知障礙。

表4 VCIND與影像學(xué)分型之間的關(guān)系〔n(%)〕

2.4CLU基因snp位點與VCIND影像學(xué)交互作用 rs11136000snp位點兩組SVD評分存在顯著性差異(P<0.001)，提示CLU基因rs11136000位點與VCIND影像學(xué)存在交互作用(表5)；攜帶rs11136000snp位點的兩組比較，在腔隙性腦梗死、腦白質(zhì)高信號中，存在顯著差異(P<0.05)，見表6。rs9331888snp位點兩組SVD總分對比，存在顯著差異(P<0.001)，提示CLU基因 rs9331888位點與VCIND影像學(xué)存在交互作用(表7)；攜帶9331888snp位點的兩組比較，在腦白質(zhì)高信號、血管間隙擴(kuò)大中存在顯著差異(P<0.05)，見表8。

表5 rs11136000snp位點VCIND患者與影像學(xué)的交互作用

表6 rs11136000snp位點VCIND患者與影像學(xué)亞型的交互作用

表7 rs9331888snp位點VCIND患者與影像學(xué)的交互作用

表8 rs9331888snp位點VCIND患者與影像學(xué)亞型的交互作用

3 討 論

VCI是指導(dǎo)致任何程度的認(rèn)知損害的各種血管性腦部病變，范圍從主觀認(rèn)知能力下降到癡呆。典型的VCI患者經(jīng)常出現(xiàn)心理遲緩和執(zhí)行功能等問題，包括高級認(rèn)知功能，如記憶力問題、行為癥狀和心理癥狀。癡呆影響著全世界4 750萬人，這個數(shù)字預(yù)計每20年翻一番。癡呆人群給全世界的醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了巨大的壓力〔7〕。因此，及早對VCIND進(jìn)行干預(yù)至關(guān)重要。對于VCIND，目前還沒有明確的遺傳危險因素，如果能夠?qū)ふ液唵蔚倪z傳和生物誘發(fā)因素將會預(yù)測VCI疾病的發(fā)生并及早干預(yù)，將會大大降低血管性癡呆的發(fā)生率。

VCI的大多數(shù)危險因素是可以改變的，因此，針對這些危險因素可能會降低VCI的發(fā)生率。根據(jù)大型數(shù)據(jù)集和計算機(jī)模型的分析，導(dǎo)致血管性癡呆的7個最常見的可干預(yù)的危險因素：肥胖、高血壓、糖尿病、高膽固醇、吸煙、低教育水平和心血管疾病，消除這些危險因素估計將減少癡呆病例的三分之一〔8，9〕。高血壓促進(jìn)認(rèn)知功能下降的機(jī)制可能是多方面的，有強(qiáng)有力的證據(jù)表明瞬時改變血流影響血管運(yùn)動能力的功能變化，高血壓還會促進(jìn)微血管稀疏、內(nèi)皮功能障礙、血腦屏障破壞、神經(jīng)血管耦合減少、神經(jīng)炎癥反應(yīng)等，從而導(dǎo)致腦部缺氧引起神經(jīng)功能障礙〔10〕。一項前瞻性、以社區(qū)為基礎(chǔ)的檀香山亞洲老齡化研究發(fā)現(xiàn)中年期血壓升高而未降壓治療者血管癡呆的風(fēng)險增加〔11〕。Tzourio等〔12〕通過4年的隨訪發(fā)現(xiàn)有高血壓史的老年人認(rèn)知功能下降的比例是無高血壓史的2.8倍。同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化成的半胱氨酸減少，則谷胱甘肽水平下降，導(dǎo)致活性氧增加、氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致腦部缺氧。既往研究〔13〕證實同型半胱氨酸水平的升高與執(zhí)行功能障礙表現(xiàn)的降低之間呈正相關(guān)。以上結(jié)果均支持我們的研究。然而在本次研究中不具有統(tǒng)計學(xué)意義的危險因素考慮可能受本次樣本量影響。

本研究在VCIND組與認(rèn)知正常組的比較中發(fā)現(xiàn)CLU基因的rs11136000snp位點攜帶者更容易出現(xiàn)認(rèn)知障礙?？紤]CLU基因多態(tài)性從以下方面影響血管性認(rèn)知障礙的發(fā)展。①CLU基因多態(tài)性的表達(dá)可使顱內(nèi)Aβ的沉積增加，破壞血腦屏障，造成大腦功能障礙和損害。CLU編碼的糖蛋白在淀粉樣蛋白斑中沉積，結(jié)合可溶性Aβ肽，與Aβ相互作用影響其構(gòu)象和毒性，也參與血腦屏障Aβ的清除〔14〕。一項小鼠模型證明沒有CLU的情況下，Aβ的清除轉(zhuǎn)移到更多的血管周圍引流〔15〕。相關(guān)研究〔16〕提示CLU聚集素不僅存在于斑塊，而且還存在于大腦內(nèi)的小動脈和毛細(xì)血管。Kim等〔17〕研究表明：大約30%的皮質(zhì)下VCI，其特征是廣泛的腦小血管疾病，在正電子發(fā)射斷層掃描上有顯著的Aβ負(fù)荷。Huang等〔18〕研究招募了5例因一側(cè)頸動脈狹窄而患有癡呆的患者，他們接受了18F-AV1451PET的檢查，結(jié)果顯示癡呆和單側(cè)頸動脈狹窄的患者與正常對照組相比，整體淀粉樣蛋白沉積明顯增加。Ye等〔19〕研究結(jié)果表明淀粉樣蛋白負(fù)荷導(dǎo)致了小血管疾病患者的認(rèn)知能力下降。一項相關(guān)研究〔20〕結(jié)果顯示腦卒中患者血漿Aβ、Aβ42和tau水平雖低于AD患者，但均高于認(rèn)知正常組，最重要的是，有癡呆的腦卒中患者的Aβ42血漿水平明顯高于非癡呆患者。一項對72例腦卒中后認(rèn)知受損患者的研究與隨訪發(fā)現(xiàn)〔21〕，有Aβ沉積的病人在腦卒中后3年內(nèi)認(rèn)知功能下降顯著。動物研究〔22〕表明，急性缺血增加了缺血損傷后不久Aβ前體蛋白的表達(dá)和Aβ的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)了Aβ在腦中的沉積和清除。故CLU基因的多態(tài)性可能與VCI的發(fā)病有關(guān)。本研究得出的數(shù)據(jù)如預(yù)期的證實了這一觀點。②CLU基因多態(tài)性可能通過血脂代謝途徑影響VCI。血管內(nèi)膜脂質(zhì)集聚，腦血管內(nèi)皮功能減弱，損害大腦的新陳代謝，繼而出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。Anna等〔23〕發(fā)現(xiàn)在致密高密度脂蛋白顆粒的子集中存在CLU表達(dá)的蛋白，它可以抑制脂質(zhì)過氧化或降解生物活性的低密度脂蛋白膽固醇氧化。既往研究表明血脂可增加血管內(nèi)皮功能的損傷和血流動力學(xué)的改變，容易造成腦卒中及認(rèn)知障礙的發(fā)生〔24〕。在曼哈頓北部腦卒中研究〔25〕以人群為基礎(chǔ)的病例對照研究中，高密度脂蛋白膽固醇水平的升高與老年人及不同種族和民族之間腦卒中風(fēng)險的降低有關(guān)，增加了與腦卒中相關(guān)的脂質(zhì)證據(jù)；在一項關(guān)于頸動脈斑塊形態(tài)相關(guān)危險因素的基于人群的橫斷面的病例對照研究中〔26〕，發(fā)現(xiàn)有回聲斑塊的受試者未來發(fā)生缺血性腦血管事件的風(fēng)險更高。在動物研究中也觀察到，喂食富含飽和脂肪和膽固醇飲食的大鼠，血腦屏障通透性增加，伴隨著認(rèn)知障礙〔27〕。結(jié)合上述結(jié)果，CLU基因多態(tài)性可能通過加劇脂質(zhì)沉積造成血管性認(rèn)知功能障礙。

血管疾病是VCI中最常見的損害；小血管疾病以動脈硬化和腔隙性梗死為特征，可引起皮質(zhì)和皮質(zhì)下微梗死，并對白質(zhì)造成彌漫性缺血性損害〔28〕。Jokinen等〔29〕在3年的隨訪中發(fā)現(xiàn)：在MRI測量的多變量模型中，總的WMH、腔隙仍然是認(rèn)知功能的獨立預(yù)測因子。上述結(jié)論與本研究的結(jié)果相同。其機(jī)制可能是阻斷了腦內(nèi)傳導(dǎo)通路從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。額葉與運(yùn)動性活動和判斷、記憶、抽象思維、情緒、心境等精神活動有關(guān)；顳葉與行為、精神、記憶有關(guān)；內(nèi)囊前肢、膝部參與投射到額葉或顳葉的路徑；丘腦受損后易產(chǎn)生記憶、言語、定向障礙，故上述部位的腔隙性腦梗死也會引起明顯的認(rèn)知功能障礙。腦白質(zhì)聯(lián)系著聯(lián)合纖維、聯(lián)絡(luò)纖維、投射纖維，腦白質(zhì)的損傷可導(dǎo)致各個腦區(qū)的信息傳遞中斷，同時也會導(dǎo)致廣泛的膽堿能系統(tǒng)受損，從而導(dǎo)致認(rèn)知障礙。Chua等〔30〕證明VCIND患者有更廣泛的腦白質(zhì)改變。Wright等〔31〕大樣本研究發(fā)現(xiàn)腦白質(zhì)病變范圍大小與認(rèn)知功能損害存在明顯正相關(guān)性，當(dāng)白質(zhì)損害累計體積大于0.75%整顱腦體積時，認(rèn)知和感覺運(yùn)動能力將受損明顯。Huijts等〔32〕對189例VCI患者研究發(fā)現(xiàn)，基底節(jié)區(qū)血管周圍間隙(EPVS)的嚴(yán)重程度與認(rèn)知障礙程度存在相關(guān)性。但是有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EPVS并不是認(rèn)知能力下降的預(yù)測指標(biāo)，Benjamin等〔33〕研究得出在5年的隨訪期內(nèi)EPVS與認(rèn)知功能下降無關(guān)。這點與本研究結(jié)果不同，可能存在EPVS與Lacunes難以區(qū)分，或者被腦白質(zhì)高信號(WMH)掩蓋。

本研究結(jié)果證實了CLU基因多態(tài)性通過使顱內(nèi)Aβ的沉積增加，影響血脂代謝途徑，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。CLU基因多態(tài)性的VCIND可能更多表現(xiàn)出腦白質(zhì)高信號。深部白質(zhì)是一個分水嶺區(qū)域，容易受到血流量和氧氣供應(yīng)減少的影響。脂代謝異?？杉又仄淙毖?。Aβ的沉積可導(dǎo)致血腦屏障破壞，從而導(dǎo)致脫髓鞘改變，最終形成WMH，導(dǎo)致VCI〔34〕。故CLU基因多態(tài)性通過使顱內(nèi)Aβ的沉積增加，破壞血腦屏障，或脂代謝異常，造成WMH從而導(dǎo)致大腦功能障礙和損害的可能性大。上述結(jié)果仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實。另外，CLU基因最初被認(rèn)為與AD有關(guān)的認(rèn)知障礙密切相關(guān)，對于其與VCI的研究較少，可加強(qiáng)縱向隨訪、增加相關(guān)研究。