郝淑月, 任 清

(北京工商大學 輕工科學技術(shù)學院，北京 100048)

生物胺(biogenic amines，BA)是一類低分子質(zhì)量的含氮堿性有機化合物的總稱,普遍存在于發(fā)酵食品中[1-2]，主要由發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基酸經(jīng)脫羧酶催化生成，包括以腐胺、尸胺、精胺和亞精胺為主的脂肪族生物胺，以酪胺和苯乙胺為主的芳香族生物胺，以組胺和色胺為主的雜環(huán)類生物胺等。少量生物胺為生物體內(nèi)的正?；钚猿煞?，但若人體過量攝入外源生物胺，會發(fā)生中毒反應，嚴重時還會危及生命[3-6]。據(jù)報道，攝入8～40 mg組胺會導致輕微中毒，攝入40 mg以上組胺引發(fā)中度中毒癥狀，酪胺在人體內(nèi)含量超過100 mg時，會引發(fā)偏頭痛[7-8]。

黃酒是我國特有的具有悠久歷史的發(fā)酵酒，其獨特的發(fā)酵工藝極易產(chǎn)生生物胺[9-10]，一方面，黃酒釀造常用的原料為小麥、糯米、黍米和小米等谷物，蛋白質(zhì)含量高，發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的游離氨基酸；另一方面，傳統(tǒng)黃酒生產(chǎn)采用開放式的半固態(tài)發(fā)酵，極易污染雜菌，這些雜菌往往是產(chǎn)生物胺菌，能夠分泌氨基酸脫羧酶，將游離氨基酸脫羧轉(zhuǎn)化為生物胺。黃酒的生物胺平均質(zhì)量濃度高達115 mg/L[11]，遠高于啤酒和葡萄酒中的生物胺平均質(zhì)量濃度(啤酒中平均質(zhì)量濃度為19.3 mg/L，葡萄酒中平均質(zhì)量濃度為8.92 mg/L)[12]。因此，降低生物胺含量已經(jīng)成為黃酒生產(chǎn)中質(zhì)量控制的重要目標。

針對黃酒生物胺合成途徑，生產(chǎn)上通常采用改進生產(chǎn)工藝來控制生物胺，例如采用乳酸菌的生物酸化浸米技術(shù)、調(diào)整貯藏溫度和控制游離氨基酸含量等技術(shù)[13-15]，雖然一定程度上降低了生物胺含量，但是，仍然不能滿足黃酒質(zhì)量安全的需求。隨著黃酒發(fā)酵微生態(tài)系統(tǒng)研究的深入，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中的雜菌是生物胺主要產(chǎn)生菌，因此，篩選能夠產(chǎn)生細菌素抑制雜菌的功能菌株，是黃酒生產(chǎn)中控制生物胺含量的有效途徑。

本團隊從黃酒酒曲中發(fā)現(xiàn)一株新菌種，命名為北工商海洋桿菌(Pontibacterbeigongshangensis)[16]，對其生物學特性研究發(fā)現(xiàn)，該菌與戊糖片球菌共培養(yǎng)，可以誘導產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，本研究擬對此分析鑒定并對其降生物胺功效進行研究，以期為降低黃酒中生物胺含量提供理論依據(jù)和有價值的微生物菌種。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃酒麥曲2種，一種北宗黃酒有限公司提供，另一種由實驗室自制；小麥和黍米，由張家口市農(nóng)業(yè)科學院提供；糖化酶(100 000 U/g)，江蘇瑞陽生物科技有限公司；北工商海洋桿菌(CGMCC 1.17104)和戊糖片球菌M25，均從北宗黃酒麥曲中分離，保存于本研究團隊實驗室；腐生葡萄球菌、阪崎腸桿菌、乳酪短桿菌、芽孢桿菌和陰溝腸桿菌，均為本研究團隊從黃酒發(fā)酵過程中分離出來的雜菌；芽孢桿菌、大腸桿菌、植物乳桿菌和酵母由本研究團隊實驗室收藏；LB培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基均按照參考文獻[17]的配方和方法配制。

生物胺檢測顯色培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5、酵母膏5、牛肉膏5、NaCl 2.5、葡萄糖0.5、Tween 80 1 mL、MgSO40.2、MnSO40.05、FeSO40.04、檸檬酸銨2、K2HPO42、CaCO30.1、磷酸吡多醛0.05、溴甲酚紫0.06、放線菌酮0.05，分別添加賴氨酸5.0(檢測尸胺)、鳥氨酸鹽酸鹽5.0(檢測腐胺)、L-組氨酸鹽酸鹽2.0(檢測組胺)、色氨酸2.0(檢測色胺)、酪氨酸1.0(檢測酪胺)、苯丙氨酸2.0(檢測苯乙胺)，調(diào)pH值至5.3，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

固體脫羧酶培養(yǎng)基(g/L)：瓊脂粉18.0，其他成分同生物胺檢測顯色培養(yǎng)基，pH=5.3，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1牛津杯抑菌實驗

采用牛津杯法分析菌株抑菌效果，指示菌株為腐生葡萄球菌、阪崎腸桿菌、乳酪短桿菌、芽孢桿菌和陰溝腸桿菌，芽孢桿菌、大腸桿菌、植物乳桿菌和酵母為待測菌株。

(1)分別將北工商海洋桿菌和戊糖片球菌M25單獨接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，制備單培養(yǎng)菌液。

(2)分別將芽孢桿菌、大腸桿菌、植物乳桿菌和酵母與戊糖片球菌共同接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，制備共培養(yǎng)菌液。

(3)在滅菌的培養(yǎng)皿中注入約25 mL LB培養(yǎng)基，均勻鋪滿培養(yǎng)皿底部，待LB培養(yǎng)基凝固后，分別加入5種100 μL指示菌懸液，均勻涂布于培養(yǎng)皿上，在表面等間距放置滅菌的牛津杯。接著將100 μL菌株共培養(yǎng)或單培養(yǎng)發(fā)酵液注入牛津杯內(nèi)，4 ℃下擴散3～5 h，然后將培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)24～36 h，觀測抑菌效果。

1.2.2北工商海洋桿菌誘導戊糖片球菌生成細菌素的驗證方法

1.2.2.1 排除有機酸的干擾

發(fā)酵上清液對指示菌的抑制作用可能是細菌素引起的，也可能是有機酸作用的結(jié)果，為排除酸的干擾，將北工商海洋桿菌與戊糖片球菌M25在MRS培養(yǎng)基中37 ℃下共培養(yǎng)24 h，10 000 r/min離心15 min，取上清液用2.5 mol/L的NaOH溶液中和至pH值達6.5～7.0，通過牛津杯雙層平板法進行抑菌試驗，向牛津杯中分別加入北工商海洋桿菌和戊糖片球菌共培養(yǎng)發(fā)酵上清液中和前以及中和后的液體100 μL，并在水平條件下將平板放于4 ℃冰箱中擴散4 h，置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，分別檢測兩者的抑菌活性，比較中和酸前后抑菌效果，每次處理3次重復。

1.2.2.2 過氧化氫作用的檢測與排除

將過氧化氫酶溶解于50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH=7.0)中配成母液，加入經(jīng)酸排除的北工商海洋桿菌和戊糖片球菌共培養(yǎng)上清液中，使過氧化氫酶的最終濃度達到5 mg/mL，37 ℃水浴2 h后取出，檢測過氧化氫酶處理后上清液的抑菌效果，每次處理3次重復。

1.2.2.3 蛋白酶敏感實驗

將蛋白酶K、胰蛋白酶胃、蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶分別溶解在50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH=7.6)中配成母液，加入共培養(yǎng)菌株發(fā)酵上清液中，使其終濃度為1 mg/mL，調(diào)節(jié)pH值至各酶的最適作用范圍，37 ℃水浴2 h后取出。再將pH值調(diào)回至6.5～7.0，并用緩沖液稀釋相同倍數(shù)的發(fā)酵上清液作為對照，檢測各種蛋白酶對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響。

1.2.3北工商海洋桿菌液濃度對戊糖片球菌抑菌效果的評價

將北工商海洋桿菌接種于MRS培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)4、8、12、24 h和36 h，10 000 r/min離心15 min，得不同濃度的上清液，加入戊糖片球菌M25培養(yǎng)液中培養(yǎng)，利用牛津杯抑菌實驗進行抑菌效果評價。

1.2.4脫羧酶培養(yǎng)基顯色反應

分別取活化后的北工商海洋桿菌和戊糖片球菌0.2 mL于固體脫羧酶培養(yǎng)基上進行涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d, 觀察顏色變化，黃色為陰性，紅色或紫色為陽性。

1.2.5黃酒麥曲的制備

1.2.5.1 普通黃酒麥曲的制備

將小麥粉碎(單粒碎為4～6瓣)，加入質(zhì)量分數(shù)20%～30%的水，攪拌均勻，踏曲、堆曲，控制溫度在45～50 ℃，自然發(fā)酵30 d即可。

1.2.5.2 原生強化功能曲的制備

北工商海洋桿菌擴培：稱取1 kg黍米，浸泡24 h，按照1 kg黍米加3 kg水的比例煮熟原料，加黍米質(zhì)量分數(shù)0.15%的糖化酶在60 ℃條件下糖化30 min，接種北工商海洋桿菌，37 ℃培養(yǎng)48 h，并進行多次攪拌。

戊糖片球菌M25擴培：稱取1 kg黍米，浸泡24 h，按照1 kg黍米加3 kg水的比例煮熟原料，加黍米質(zhì)量分數(shù)為0.15%的糖化酶在60 ℃條件下糖化30 min，接種戊糖片球菌M25，37 ℃培養(yǎng)48 h，并進行多次攪拌。

原生強化功能曲的制備：將小麥粉碎(單粒碎為4～6瓣)，加入小麥質(zhì)量分數(shù)20%～30%水，同時，加入北工商海洋桿菌和戊糖片球菌M25兩種體積分數(shù)為1%的菌株擴培液，攪拌均勻，踏曲，堆曲，控制溫度在45～50 ℃，自然發(fā)酵30 d即可。

1.2.6黃酒的釀造

1)浸米蒸煮：將1 kg黍米洗凈并浸泡24 h，按照1 kg黍米加3 kg水的比例煮熟黍米(約1 h)，使黍米變軟無生芯。

2)糖化：將黍米質(zhì)量分數(shù)為0.15%的糖化酶在60 ℃條件下活化5 min，當蒸煮后的黍米飯溫度下降至60 ℃時加入活化的糖化酶，糖化30 min。

3)發(fā)酵：加入黍米質(zhì)量分數(shù)16%的酒曲和0.15%的酵母拌勻，裝入黃酒發(fā)酵罐中30 ℃下前發(fā)酵5～8 d，然后在13～17 ℃條件下后發(fā)酵(22～25 d)至1個月。

4)榨酒澄清：采用真空抽濾的方法過濾滅菌，靜置2～3 d，棄底層混濁，得成品黃酒。

5)滅菌：85 ℃下高溫滅菌30 min。

1.2.7生物胺含量的測定

按照1.2.5節(jié)釀造黃酒，采用HPLC的方法依據(jù)國家標準(GB 5009.208—2016《食品中生物胺含量的測定》)檢測生物胺含量[18]，比較普通麥曲釀造黃酒和原生強化功能曲釀造黃酒的生物胺含量差異，重復3次，進行差異顯著性分析。

1.2.8黃酒揮發(fā)性風味物質(zhì)的檢測

黃酒揮發(fā)性風味物質(zhì)的檢測方法、色譜條件與參考文獻[17]相同，比較普通麥曲釀造黃酒和原生強化功能曲釀造黃酒的揮發(fā)性風味物質(zhì)的差異，重復3次，進行差異顯著性分析。

1.2.9黃酒氨基酸態(tài)氮、非糖固形物、總糖、酒精度和酸度的檢測

采用國家標準(GB/T 13662—2018《黃酒》)分析檢測黃酒氨基酸態(tài)氮、非糖固形物、總糖、酒精度和酸度[19]，比較普通麥曲釀造黃酒和原生強化功能曲釀造黃酒的氨基酸態(tài)氮、非糖固形物、總糖、酒精度和酸度，重復3次，進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 北工商海洋桿菌和戊糖片球菌共培養(yǎng)的抑菌功效

采用牛津杯法分析北工商海洋桿菌和戊糖片球菌共培養(yǎng)的抑菌效果，見圖1、圖2和表1。北工商海洋桿菌和戊糖片球菌共培養(yǎng)及其無菌發(fā)酵液均有抑菌活性，而這兩種菌分別培養(yǎng)，其菌液和無菌發(fā)酵液均沒有抑菌活性。戊糖片球菌分別與芽孢桿菌、大腸桿菌、植物乳桿菌、和酵母共培養(yǎng)，同樣沒有抑菌活性，說明只有北工商海洋桿菌和戊糖片球菌共培養(yǎng)才具有抑菌活性，產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對腐生葡萄球菌、阪崎腸桿菌、乳酪短桿菌、芽孢桿菌和陰溝腸桿菌均具有抑制效果。

A為北工商海洋桿菌和戊糖片球菌共培養(yǎng)菌株；B為北工商海洋桿菌菌株；C為戊糖片球菌菌株。

表1 戊糖片球菌共培養(yǎng)發(fā)酵抑菌實驗

A為北工商海洋桿菌和戊糖片球菌共培養(yǎng)上清液；B為北工商海洋桿菌上清液；C為戊糖片球菌上清液。

2.2 北工商海洋桿菌誘導戊糖片球菌生成細菌素的驗證分析

北工商海洋桿菌和戊糖片球菌分別單菌發(fā)酵，北工商海洋桿無菌發(fā)酵液添加到戊糖片球菌發(fā)酵液中培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物具有抑菌活性；反之，戊糖片球菌無菌發(fā)酵液添加到北工商海洋桿菌發(fā)酵液中培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物沒有抑菌活性(見表2)。由此可知，抑菌物質(zhì)是在北工商海洋桿菌的誘導下由戊糖片球菌發(fā)酵產(chǎn)生的。

表2 細菌素的驗證分析實驗

排除有機酸和過氧化氫實驗結(jié)果表明，抑菌特性不是因為發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸和過氧化氫引起的，而是因為北工商海洋桿菌的誘導下由戊糖片球菌產(chǎn)生了抑菌物質(zhì)，經(jīng)蛋白酶K和胰蛋白酶降解后，失去了抑菌活性，說明該物質(zhì)為蛋白質(zhì)或多肽，為細菌素類物質(zhì)，該細菌素具有比較廣譜的抑菌活性，而且對蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，但是，對胃蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶的酶敏感性較弱。

2.3 北工商海洋桿菌培養(yǎng)液濃度對戊糖片球菌抑菌效果的影響

北工商海洋桿菌培養(yǎng)液濃度對戊糖片球菌抑菌效果的影響見表3，北工商海洋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)前期，培養(yǎng)液濃度低，加入戊糖片球菌培養(yǎng)中，戊糖片球菌沒有抑菌活性，隨著北工商海洋桿菌培養(yǎng)時間的延長，直到24 h或36 h后，培養(yǎng)液濃度提高，可以刺激或誘導戊糖片球菌具有了抑菌活性。這說明北工商海洋桿菌培養(yǎng)液高濃度產(chǎn)生了某些物質(zhì)，這些物質(zhì)是誘導劑，誘導戊糖片球菌合成了細菌素。

表3 北工商海洋桿菌培養(yǎng)液濃度對抑菌效果的影響

2.4 北工商海洋桿菌和戊糖片球菌產(chǎn)生物胺特性分析

脫羧酶培養(yǎng)基顯色反應實驗中，培養(yǎng)初期，細菌繁殖，利用葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)液pH值下降，溴甲酚紫指示劑變黃色，繼續(xù)培養(yǎng)，若細菌產(chǎn)氨基酸脫羧酶，則氨基酸在脫羧酶的作用下發(fā)生脫羧反應生成胺和二氧化碳，pH值上升呈堿性，使含指示劑的培養(yǎng)基由黃色變?yōu)樽仙?，由此，可通過培養(yǎng)基顏色變化判斷細菌是否產(chǎn)生物胺。

脫羧酶培養(yǎng)基顯色反應結(jié)果見表4，培養(yǎng)腐生葡萄球菌和阪崎腸桿菌，能夠產(chǎn)腐胺、酪胺、尸胺、組胺和苯乙胺5種常見的生物胺；乳酪短桿菌產(chǎn)腐胺、酪胺、尸胺和組胺4種生物胺；芽孢桿菌產(chǎn)酪胺、尸胺、組胺和苯乙胺4種生物胺；陰溝腸桿菌產(chǎn)腐胺、酪胺、尸胺和苯乙胺4種生物胺。但是，北工商海洋桿菌和戊糖片球菌培養(yǎng)過程中沒有檢測到生物胺的產(chǎn)生，說明這兩株菌自身不產(chǎn)生物胺。

表4 生物胺顯色反應實驗

2.5 強化功能曲對黃酒生物胺的影響

添加北工商海洋桿菌和戊糖片球菌，制備強化功能曲，利用強化功能曲釀造黃酒，應用HPLC檢測黃酒中的生物胺含量，實驗結(jié)果如圖3。強化功能曲釀造的黃酒與對照普通曲釀造的黃酒相比，各種生物胺含量均明顯降低，生物胺總含量降低29.8%。表明添加強化北工商海洋桿菌和戊糖片球菌可以顯著降低黃酒中的生物胺的含量，提高黃酒品質(zhì)，可能是因為北工商海洋桿菌誘導戊糖片球菌產(chǎn)生細菌素，有效抑制了一些產(chǎn)生物胺雜菌的生長繁殖，而北工商海洋桿菌和戊糖片球菌本生不產(chǎn)生物胺，因此，應用強化功能曲釀造黃酒，可以顯著降低黃酒中的生物胺含量。

圖3 2種黃酒中生物胺的含量

2.6 強化功能曲對黃酒風味品質(zhì)的影響

添加北工商海洋桿菌和戊糖片球菌，制備強化功能曲，利用強化功能曲釀造黃酒，應用GC-MS檢測黃酒中的香味物質(zhì)，實驗結(jié)果見表5和表6，強化功能曲釀造的黃酒中檢測出烷烴類、醇類、酯類、酮類、醛類、酸類、吡嗪類、酚類和其他風味物質(zhì)共105種，普通曲釀造的黃酒中，共檢測出風味物質(zhì)102種，而且風味物質(zhì)除了酯類物質(zhì)顯著增加外，其他種類的風味物質(zhì)和風味物質(zhì)的總含量均沒有顯著差異。表明黃酒發(fā)酵工程中，強化添加北工商海洋桿菌和戊糖片球菌對黃酒的風味品質(zhì)基本沒有影響。

表5 2種黃酒中香味物質(zhì)的種類

表6 2種黃酒中香味物質(zhì)的含量

添加北工商海洋桿菌和戊糖片球菌，制備強化功能曲，利用強化功能曲釀造黃酒，分析檢測黃酒中的總酸、總糖、非糖固形物、氨基酸態(tài)氮和酒精度，實驗結(jié)果如表7所示，利用強化功能曲釀造的黃酒與對照黃酒相比，酒精度、總糖和非糖固形物沒有明顯變化，氨基酸態(tài)氮含量顯著提高，酸度提高。分析原因，可能因為利用強化功能曲釀造黃酒，北工商海洋桿菌誘導戊糖片球菌合成細菌素，有效抑制了一些產(chǎn)生物胺雜菌的生長繁殖，氨基酸轉(zhuǎn)化合成生物胺減少，氨基酸積累增多，因此，氨基酸態(tài)氮含量提高，總酸含量提高。

表7 2種黃酒常規(guī)品質(zhì)分析

3 討論與結(jié)論

黃酒生產(chǎn)上，針對黃酒生物胺的生物合成機制，通常從3個方面控制和降低生物胺的含量。首先，釀酒原料選擇和處理上, 選擇蛋白質(zhì)含量低的原料或控制蛋白質(zhì)的水解，可以影響游離氨基酸的含量水平，進而控制生物胺的生成量 但同時也會影響到黃酒的營養(yǎng)價值和風味品質(zhì)；其次，通過發(fā)酵工藝控制生物胺，謝廣發(fā)利用生物酸化浸米技術(shù)，降低了生物胺濃度[13]。但是，總體來說，改進工藝的方法費時費力，效率低，往往是針對特定企業(yè)的酒，不具有普適性；此外，篩選利用特定菌種，篩選不產(chǎn)生物胺的菌株、有效分解生物胺的菌株或者能抑制含脫羧酶菌株生長的菌株。不影響產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，如果可以篩選得到既無氨基酸脫羧酶活性又可產(chǎn)生有效抑制劑的菌株，則理論上效果更佳。

北工商海洋桿菌是由本課題組發(fā)現(xiàn)的新菌種，用發(fā)現(xiàn)單位北京工商大學校名命名，該新菌種能夠誘導戊糖片球菌產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，是種間誘導產(chǎn)生的一種細菌素，誘導效果與菌體密度有關(guān)，關(guān)于其誘導合成機制，需要進一步分析研究。

北工商海洋桿菌和戊糖片球菌自生發(fā)酵不產(chǎn)生物胺，添加北工商海洋桿菌和戊糖片球菌，制備強化功能曲，利用強化功能曲釀造黃酒，北工商海洋桿菌誘導戊糖片球菌產(chǎn)生的細菌素抑制了產(chǎn)生物胺雜菌，黃酒的生物胺含量顯著降低，氨基酸態(tài)氮含量顯著提高，香味物質(zhì)和酒精度沒有明顯變化，提高和改善了黃酒品質(zhì)，從釀酒微生物相互作用方面，探索了一條降低黃酒生產(chǎn)中生物胺含量的新途徑，提供了優(yōu)質(zhì)的菌種資源，將會在黃酒釀造和品質(zhì)改良中發(fā)揮重要的作用。