秦文娟，潘梅萍，蘇澤杰，侯茹蓉，陸海杰,3*，樂志操

(1.廈門大學附屬中山醫(yī)院腫瘤放療科，福建廈門361004；2.福州大學生命科學研究所，福建福州350116；3.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院放療科，福建福州35001;4.深圳大學醫(yī)學部，卡爾森國際腫瘤中心，廣東深圳518060)

生物鐘，即對生命活動的晝夜節(jié)律控制，在多方面影響人體健康[1-2].生物鐘節(jié)律的破壞與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，對腫瘤治療也有重要影響[1-4].目前有很多研究試圖開發(fā)調(diào)控生物鐘的小分子藥物，以促進對代謝疾病和腫瘤的治療[5-8].

中樞生物鐘由大腦海馬區(qū)的視交叉上核控制，在光照的影響下形成周期性的基因表達模式，并通過激素及其他信號分子調(diào)控外周組織的生物鐘[1,9].中樞生物鐘與外周組織的生物鐘如何偶聯(lián)并受到調(diào)控是一個重要問題，但具體機制至今仍不清楚.通常認為生物鐘節(jié)律在基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性方面受到多重反饋機制的調(diào)控，其中最重要的是CLOCK與BMAL1組成的轉(zhuǎn)錄活化因子復合體，以及PERIOD(PER)與CRYPTOCHROME(CRY)組成的轉(zhuǎn)錄抑制因子復合體，共同調(diào)節(jié)相關(guān)基因的周期性表達[1].此外，神經(jīng)肽、激素(如褪黑素和甲狀腺素)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、鈣離子信號、核因子κB(NF-κB)信號等都可以調(diào)節(jié)生物鐘的周期性和相關(guān)基因的表達[10-15].

雖然生物鐘相關(guān)基因在每個細胞中都有表達，但是因其節(jié)律是獨立調(diào)控的，故在體外培養(yǎng)的情況下缺乏整體的同步化機制.為此，有研究開發(fā)了單細胞報告基因技術(shù)，在單細胞水平進行實時檢測[8]，但該方法并不容易進行.為了在培養(yǎng)腫瘤細胞的群體水平觀察到周期性的生物鐘相關(guān)基因表達，有研究者提出通過添加Forskolin活化cAMP信號通路，對培養(yǎng)細胞的生物鐘進行同步化處理[13].為了更好地觀察到周期性的生物鐘相關(guān)基因表達，人們還開發(fā)了增強生物鐘節(jié)律的小分子藥物如Nobiletin，以提高觀察效果[8].然而，在體外培養(yǎng)的細胞群體中仍然難以實現(xiàn)周期性的生物鐘相關(guān)基因表達.

生物鐘對腫瘤治療的效果及預后有重要影響[16-22].根據(jù)生物鐘調(diào)節(jié)組織細胞活性的作用，人們形成了時辰放化療的概念，即根據(jù)特定的生物節(jié)律給予治療，可以看到腫瘤細胞不同的反應情況，有望增強治療效果并降低副作用[23-27].在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中獲得并維持生物鐘同步化的腫瘤細胞是研究的一個難點.為此，本研究采用懸浮培養(yǎng)的方法，維持細胞間通訊，以有效實現(xiàn)生物鐘同步化，同時將其用于進一步的擇時給藥實驗以評估化療藥物的時辰反應.

1 材料和方法

1.1 材 料

人結(jié)腸癌細胞HCT116購自中國科學院細胞庫(上海，目錄號TCHu 99)，細胞培養(yǎng)采用的DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)購自ThermoFisher公司(Gibco)，胎牛血清購自Hyclone公司.Forskolin購自Sigma-Aldrich公司(F6886)，Nobiletin購自MedChemExpress公司(HY-N0155)，提取細胞總RNA采用的Trizol試劑購自南京諾維贊生物科技有限公司(R401-01)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)購自Fermentas公司(K1622)，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司(CW0957)，其他生化試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司.qRT-PCR在Roche LC-480 qRT-PCR儀上完成，細胞觀察采用Nikon Eclipse Ti倒置熒光顯微鏡，臺盼蘭(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，C0011)活性染色照相采用Leica DM6000B正置顯微鏡.

1.2 細胞貼壁培養(yǎng)

HCT116細胞在完全DMEM(含10%(體積分數(shù))胎牛血清)中，于37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細胞長滿后以1∶3稀釋傳代至24孔板中.待細胞長滿后，加入含10 μmol/L Forskolin的完全DMEM進行2 h同步化處理，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，再加入含5 μmol/L Nobiletin的DMEM完全培養(yǎng)基增強生物鐘基因表達.每4～6 h取樣一次，各孔作為一個獨立樣品.

1.3 細胞懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)采用6 cm 細菌培養(yǎng)板(Biofil,廣州潔特生物過濾有限公司)，每板加入數(shù)量為2×106的HCT116細胞.培養(yǎng)2 d后，加入含10 μmol/L Forskolin的完全DMEM進行2 h同步化處理，然后用PBS洗滌一次，加入含5 μmol/L Nobiletin的完全DMEM增強生物鐘基因表達.每6 h取樣一次，取樣時以200 μL吸頭取約50 μL細胞培養(yǎng)液進行基因表達分析.細胞活性通過0.1%(質(zhì)量分數(shù))臺盼蘭染色檢測，按照試劑盒說明操作.

1.4 細胞總RNA提取和qRT-PCR

細胞總RNA提取采用Trizol法，按照試劑盒說明操作.總RNA經(jīng)DNA酶消化后反轉(zhuǎn)錄為cDNA.經(jīng)凝膠電泳檢驗基因擴增的特異性后，進行qRT-PCR基因表達定量分析.PCR條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.采用β-ACTIN作為參比基因，以2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量[28].所用引物及序列見表1.

表1 本研究所用引物及其序列Tab.1 Primers used in this study and their sequences

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示.差異顯著性分析采用雙尾t-檢驗，顯著性水平表示如下：***p<0.001.

2 結(jié)果與分析

2.1 HCT116細胞模型中生物鐘基因的動態(tài)表達情況

采用HCT116細胞為模型，檢測其生物鐘相關(guān)基因的動態(tài)表達情況.對照組中，傳代后的細胞未進行處理，在不同時間點進行取樣檢測發(fā)現(xiàn)CLOCK、BMAL1、PER2基因的表達均未表現(xiàn)出明顯的周期性特征(圖1(a)～(c)).當以10 μmol/L Forskolin處理2 h對細胞進行生物鐘同步化后，再繼續(xù)培養(yǎng)于含5 μmol/L Nobiletin的條件下，可以看到CLOCK和PER2的表達表現(xiàn)出一定的24 h周期性特征(圖1(d)和(f))，但BMAL1的表達仍沒有同步化(圖1(e)).因此，在貼壁培養(yǎng)的腫瘤細胞模型中，很難在群體水平獲得周期性的生物鐘基因表達模式.

(a～c)對照組；(d～f)同步化處理組.圖1 同步化處理對貼壁培養(yǎng)的HCT116細胞生物鐘基因表達的影響Fig.1Impact of synchronization on the biological clock gene expression in monolayer cultured HCT116 cells

2.2 懸浮培養(yǎng)的HCT116細胞中生物鐘基因表達情況

為了維持培養(yǎng)細胞間的聯(lián)系和通訊，參考胚胎干細胞培養(yǎng)中在低黏附的細胞培養(yǎng)板上形成胚樣小體以進行體外細胞分化的方法[29]，將腫瘤細胞在低黏附的細菌培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng)，使細胞保持在同樣的環(huán)境中，且可以定時多次取樣分析.在這種培養(yǎng)條件下，細胞保持懸浮狀態(tài)，與同時期貼壁培養(yǎng)的細胞相比數(shù)目略有減少，但仍保持正常擴增(圖2)，可見該方法可以保持腫瘤細胞的活性.

圖2 懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)的HCT116細胞生長情況Fig.2Growth of suspension and monolayer cultured HCT116 cells

對懸浮培養(yǎng)的HCT116細胞進行基因表達檢測.在未經(jīng)Forskolin 同步化處理的懸浮培養(yǎng)細胞中，周期性的生物鐘基因表達不明顯(圖3(a)～(c))；經(jīng)同步化處理后，3個生物鐘相關(guān)基因CLOCK、BMAL1和PER2均表現(xiàn)出一定周期性的動態(tài)表達(圖3(d)～(f)).可見通過同步化處理以后，懸浮培養(yǎng)的腫瘤細胞可以表現(xiàn)出生物鐘的節(jié)律性.

2.3 懸浮培養(yǎng)的HCT116細胞對化療藥物的時辰反應

(a～c)對照組；(d～f)同步化處理組.圖3 懸浮培養(yǎng)的HCT 116細胞生物鐘基因的周期性表達Fig.3Periodic rhythm expression of biological clock genes in suspension cultured HCT116 cells

(a)同步化的細胞對化療藥物5-FU的時辰反應;(b)未同步化的細胞(1 h)對化療藥物5-FU的反應差異.***p<0.001.圖4 HCT116細胞對化療藥物5-FU的時辰反應差異Fig.4Differences in circadian clock response of HCT116 cells to chemotherapeutic drug 5-FU

為檢驗上述懸浮培養(yǎng)方法是否能用于評價化療藥物的時辰反應，將治療結(jié)直腸腫瘤的藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)在不同節(jié)律點加入，檢測其引起腫瘤細胞反應的差異，包括對生長和凋亡基因P21和FAS的表達調(diào)控[23-25].結(jié)果顯示：在同步化處理4或20 h后加入5-FU均不能引起顯著的反應，而在同步化處理12 h 后加入5-FU則引起了P21和FAS基因表達水平的顯著上升(圖4(a))，由此表明懸浮培養(yǎng)的腫瘤細胞可以表現(xiàn)出對化療藥物的時辰反應；如不添加Forskolin進行生物鐘同步化處理，則5-FU 不能引起P21和FAS基因的表達變化(圖4(b))，這可能是因為培養(yǎng)體系中加入的Nobiletin具有抗氧化劑的功能，對細胞起到了一定的保護作用.在未同步化的細胞培養(yǎng)體系中，如不添加Nobiletin，可以看到P21基因的表達變化不顯著，而FAS基因的表達明顯上升(圖4(b))，說明化療藥物5-FU本身可在1 h內(nèi)引起明顯的基因表達變化，但不同基因的表達動態(tài)存在一些差異.

3 討 論

3.1 生物鐘的同步化新方法

營養(yǎng)、激素和神經(jīng)肽等分子都是調(diào)控外周生物鐘的分子[10-15]，但在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞中缺乏這些校準和調(diào)控因素.因此，盡管每個細胞都表達生物鐘相關(guān)基因，但是在群體水平上這些生物鐘無法同步化且不能形成周期性的基因表達模式.本研究結(jié)果表明，即使進行了同步化處理，若細胞培養(yǎng)于不同條件(如不同培養(yǎng)孔)，一旦失去相互通訊和群體水平的調(diào)控，其周期性節(jié)律也會很快丟失.因此，推測生物鐘的同步化與體內(nèi)各組織器官和細胞間的通訊密切相關(guān).

為了實現(xiàn)體外培養(yǎng)的腫瘤細胞中生物鐘相關(guān)基因的周期性表達，本研究借鑒了胚胎干細胞體外分化所采用的懸浮培養(yǎng)方法[29].另有研究提出對腫瘤組織進行類器官(organoid)培養(yǎng)，也是在類似低黏附的情況下進行細胞團懸浮培養(yǎng)[30-31].本研究結(jié)果表明，在這種情況下對細胞進行同步化處理后，能夠較好地保持一致的生物鐘基因表達動態(tài).腫瘤細胞獲得不依賴于基質(zhì)的生存和遷移能力后，在不貼壁的情況下仍然能夠保持正常生長和活力，這與正常組織細胞有較大區(qū)別，也是本研究中能夠進行懸浮培養(yǎng)的保障.本研究的方法在原理上與這些方法類似，但操作簡單，且對培養(yǎng)板的材料選擇不需要具有細胞貼壁的功能，可更加廣泛地應用.

3.2 時辰放化療

前期較多報道[23-27]發(fā)現(xiàn)不同時間段給藥后，腫瘤對放化療的反應有較大差異，因而形成了時辰放化療的概念.許多臨床實驗發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)化療模式相比，包括卵巢癌[32]、肺癌[33]、膠質(zhì)母細胞瘤[34]等疾病，時辰化療在不降低療效的前提下，明顯降低了藥物毒副作用，提高了治療的依從性.這與機體自身的生物鐘節(jié)律相關(guān)，也與藥物的代謝動力學密切相關(guān).選擇合適的用藥時機，有望達到最大化的殺傷腫瘤細胞效果和最小的毒副作用，從而改善患者生存質(zhì)量.

5-FU是治療消化道腫瘤常用的化療藥.研究表明，5-FU代謝的限速酶二氫嘧啶脫氫酶(DPD)的晝夜分泌具有明顯的節(jié)律性，從22：00—次日10：00 連續(xù)12 h給藥，最佳給藥時間是凌晨4：00，其活性較其他時間提高了50%以上[23].本研究也發(fā)現(xiàn)，在同步化處理12 h 后，5-FU引起了最強的P21和FAS反應，而其他時間給藥或未同步化處理的細胞則沒有明顯反應.因此，生物節(jié)律確實可以導致不同的藥物反應，為時辰化療的概念提供了支持證據(jù).后續(xù)研究將針對生物節(jié)律如何導致藥物反應差別進一步探討.其他藥物如順鉑、草酸鉑等也表現(xiàn)出顯著的時辰治療效應[23-27].本研究中基于懸浮細胞的系統(tǒng)也適用于探討這些藥物的生物節(jié)律反應特征.

4 結(jié) 論

本研究建立了在體外細胞懸浮培養(yǎng)中同步化生物鐘的新方法，并基于該方法對腫瘤細胞的時辰給藥反應進行了探討，發(fā)現(xiàn)同步化的細胞對化療藥物表現(xiàn)出明顯的時辰反應.作為原理驗證，在此只檢測了一種細胞類型，但理論上該方法可以應用于其他類型的腫瘤細胞培養(yǎng)，從而有助于生物鐘與腫瘤治療的相關(guān)研究，可進一步豐富我們對生物鐘如何影響腫瘤治療的認識.