李兵兵 季 霞 闕揚銘

嘉興市第二醫(yī)院消化內(nèi)科 (浙江 嘉興, 314000)

姜科植物姜黃是一種天然調(diào)味品和食用色素原料，其主要成分之一姜黃素是一種酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用，價格低廉、毒性低，已被各國學(xué)者廣泛應(yīng)用于肝臟疾病的相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究[1]。雖然多項研究表明姜黃素可延緩非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的發(fā)生發(fā)展，但其機制尚不十分明確。近年來研究表明肝細(xì)胞凋亡在NASH的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用[2]，姜黃素對非腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用已被證實，并已用于多種相關(guān)疾病的研究，但國內(nèi)外關(guān)于姜黃素對NASH的抗細(xì)胞凋亡作用及機制的相關(guān)研究并不多。因此，本研究通過游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞，建立NASH的體外細(xì)胞模型，并給予姜黃素干預(yù)，探討姜黃素對NASH肝細(xì)胞凋亡及JNK信號通路活化的影響，為該中藥用于防治NASH提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 HL-7702細(xì)胞(杭州浩克生物技術(shù)有限公司)，姜黃素(Sigma, 78246-100MG)，棕櫚酸(Sigma, P0500-10G)，油酸(Sigma, O-1008-1G)，1640培養(yǎng)液(Biological, 10437028)，胎牛血清(GIBICO, 10437028)，0.25%Trypsin(GIBICO, 25200056)，二甲基亞砜(Sigma, D2650)、Annexin V-FITC/PI Staining Solution、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Yeasen, 40302ES50)，JNK I抗及p-JNK Ⅰ抗(abcam)，二抗(Jackson Immuno Research)，熒光顯微鏡(Olympus, CKX41)，離心機(長沙東旺, TD5K-Ⅱ)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo, 311)，自動化酶免分析儀(北京天石醫(yī)療用品制作所, SM-3)，流式細(xì)胞儀(BD, FACSCalibur)，Western Blot電泳儀(BIO-RAD)，Western Blot轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝HL-7702細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2的溫箱中培養(yǎng)72 h，細(xì)胞70%～80%融合時，用不含EDTA的胰酶消化傳代，更換培養(yǎng)液。

1.2.2 藥物干預(yù)及分組處理 取對數(shù)生長期的細(xì)胞1×105/ml種植到96孔板孵育24 h后，實驗分為對照組、模型組、低劑量治療組(姜黃素10 μmol/L干預(yù))、高劑量質(zhì)量組(姜黃素20 μmol/L干預(yù))。對照組用原培養(yǎng)液培養(yǎng)，而模型組、治療組均用內(nèi)含濃度為1.0 mmol/L的游離脂肪酸(FFA，PA∶OA=1∶2)的培養(yǎng)液培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化后，300 g、4℃離心5 min收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，收集(1～5)×105細(xì)胞。加入100 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，取5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI Staining Solution加入細(xì)胞懸液中混勻，避光，室溫反應(yīng)10 min，加入400 μl 1×Binding Buffer混勻后于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Western Blot法檢測各組p-JNK的表達(dá) 取出細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌2次，IP裂解液冰上裂解細(xì)胞，后加4×loading buffer，沸水浴煮5 min，冰上冷卻后把蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，蛋白變性后，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在封閉液中室溫封閉1 h，加入一抗稀釋液，4℃雜交過夜，TBST洗膜5 min×3次后，再加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液室溫孵育1 h，TBST 洗膜5 min×3次，行ECL化學(xué)發(fā)光曝光、顯影。對感光膠片條帶進(jìn)行灰度值分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶 β-actin的比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 4組肝細(xì)胞的凋亡率比較 4組肝細(xì)胞的早期、晚期及總凋亡率均存在統(tǒng)計學(xué)差異；模型組與對照組相比，早期及總凋亡率均明顯增高，而高、低劑量治療組的早期及總凋亡率均較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖1及表1。

表1 4組肝細(xì)胞凋亡率的比較

圖1 4組肝細(xì)胞凋亡的流式檢測結(jié)果(Q1：機械損傷；Q2：晚期凋亡；Q3：正常；Q4：早期凋亡；總凋亡=Q4+Q2)

2.2 4組肝細(xì)胞p-JNK表達(dá)的比較 4組肝細(xì)胞的p-JNK表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=23.62，P<0.01)，其中模型組p-JNK的表達(dá)高于對照組，低劑量治療組低于模型組，而高劑量治療組的p-JNK表達(dá)降低較低劑量治療組更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖2、3。

圖2 p-JNK蛋白在4組肝細(xì)胞中表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

圖3 p-JNK蛋白在4組肝細(xì)胞中相對表達(dá)量的比較(模型組 vs. 對照組，低劑量治療組 vs. 模型組，高劑量治療組 vs. 低劑量治療組；均P<0.05)

3 討論

NASH的持續(xù)存在已成為肝硬化甚至肝癌的重要因素之一，有10%～25%的NASH患者在10～20年內(nèi)進(jìn)展為肝硬化，甚至肝癌[3]。肝細(xì)胞凋亡在NASH的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。實驗證實NASH患者肝組織活檢標(biāo)本的肝細(xì)胞凋亡數(shù)較單純脂肪肝組或正常對照組顯著升高，并隨NASH炎癥及纖維化嚴(yán)重程度增加而增加[4]。本實驗通過1 mmol/L的FFA干預(yù)正常人肝細(xì)胞來建立NASH的體外細(xì)胞模型，結(jié)果顯示模型組細(xì)胞的早期凋亡率及總凋亡率均較對照組高，再次證實了肝細(xì)胞凋亡在NASH發(fā)展中的作用。

MAPKs是存在于細(xì)胞漿內(nèi)的一類具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點的蛋白激酶家族，參與細(xì)胞生長、增殖、分化等多種生理過程并能將多種信號通過磷酸化傳遞到細(xì)胞核中[5,6]。因此，MAPKs信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，而c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是該系統(tǒng)中的信號通路之一，在多種生理、病理的程序性細(xì)胞死亡過程中起重要的調(diào)控作用[7]。目前很多研究表明JNK通路的激活與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，且JNK信號通路是誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的重要信號通路，該通路在NAFLD發(fā)病中起重要作用[8-10]。過多的脂類物質(zhì)、ROS及炎癥介質(zhì)等可激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通道，該激酶可通過磷酸化而活化下游調(diào)節(jié)蛋白JNK，持續(xù)的JNK活化不僅可抑制線粒體呼吸鏈，增加ROS的生成，還可進(jìn)一步調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的含量和比例、致使細(xì)胞色素從cyt-C釋放，通過死亡受體途徑和線粒體等途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促使NASH的發(fā)病[11]。姜黃素可抑制MAPK激酶激酶1介導(dǎo)的JNK活化，有效阻斷核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和NF-κB等下游信號途徑[12,13]。Yu等[14]體內(nèi)外研究表明，姜黃素與JNK特異性阻斷劑SP600125作用相似，能通過抑制上游信號絲裂原活化蛋白激酶激酶4和下游底物c-Jun的磷酸化，進(jìn)而抑制JNK信號通路激活，從而產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用。目前已有較多國內(nèi)外研究證實了姜黃素通過抑制JNK磷酸化而降低心、腦、肺、腎、血管等組織的細(xì)胞凋亡[15-17]。本研究首次將姜黃素用于FFA誘導(dǎo)的NASH體外細(xì)胞模型并檢測肝細(xì)胞凋亡及p-JNK的表達(dá)，與既往研究結(jié)果一致[18]，姜黃素可顯著降低NASH的肝細(xì)胞凋亡水平，且呈劑量相關(guān)，結(jié)果亦顯示與模型組相比，各組間的p-JNK的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明了姜黃素減弱NASH的肝細(xì)胞凋亡同時，抑制了JNK的活化，且姜黃素的抗凋亡作用可能與其抑制JNK過度活化相關(guān)，具體機制需進(jìn)一步研究。