劉蕊潔 楊先照 張嘉鑫 葉永安△

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院肝病科 (北京， 100730) 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球致死性最高死亡腫瘤之一[1]，起病隱匿，發(fā)展迅速，預(yù)后差[2]。慢性肝炎→肝纖維化、肝硬化→HCC的發(fā)病規(guī)律已為學(xué)界廣泛共識(shí)[3]，針對(duì)肝硬化結(jié)節(jié)的早期干預(yù)有望改善HCC預(yù)后[4]。肝硬化到肝癌的惡性演變過(guò)程中，經(jīng)歷一個(gè)比較漫長(zhǎng)的時(shí)期——肝癌前病變期[5]。目前病理學(xué)上對(duì)肝癌前病變的認(rèn)識(shí)通常為在慢性乙型肝炎等肝病背景下，肝組織出現(xiàn)一定的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)上的異型性，形成具有潛在惡變風(fēng)險(xiǎn)的異型增生結(jié)節(jié)，此外，糖原貯積病相關(guān)肝細(xì)胞腺瘤和(非)酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝硬化等病變也有發(fā)生HCC的報(bào)道，因而通常也被視為肝癌癌前風(fēng)險(xiǎn)病變[5]。肝癌前病變是肝硬化結(jié)節(jié)進(jìn)一步發(fā)展的結(jié)果，也是肝細(xì)胞癌變時(shí)啟動(dòng)、促進(jìn)和演變過(guò)程的中間階段，是阻斷癌變的理想時(shí)機(jī)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞異常增生引起肝纖維化、肝癌等慢性肝病的同時(shí)，還伴隨著肝細(xì)胞凋亡失衡[7]。肝細(xì)胞凋亡貫穿肝臟慢性炎癥、肝纖維化、肝癌的全過(guò)程，但在不同病理階段存在動(dòng)態(tài)變化，如長(zhǎng)期的肝損傷啟動(dòng)肝內(nèi)細(xì)胞凋亡，凋亡小體和其他細(xì)胞碎片被肝星狀細(xì)胞(HSC)吞噬，引起HSC的活化、增殖，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)堆積、肝纖維化形成[8]；肝細(xì)胞再生過(guò)程中，細(xì)胞凋亡可清除異常的肝細(xì)胞，細(xì)胞凋亡不足，則可導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[9]；而當(dāng)肝癌形成后，細(xì)胞凋亡水平下降[10]。

益肝消癥方由葉永安教授經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐創(chuàng)立并優(yōu)化，具有疏肝健脾、活血化痰解毒等功效。前期研究顯示，益肝消癥方可通過(guò)抑制肝細(xì)胞外基質(zhì)堆積、細(xì)胞異常增生及保護(hù)肝細(xì)胞，有效干預(yù)二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的大鼠肝癌前病變[11]。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)肝癌前病變階段主要凋亡因子Bcl-2、Bax以及益肝消癥方對(duì)該通路的影響做初步探索。該方原名抗纖抑癌方，根據(jù)我國(guó)藥監(jiān)局2017年1月頒布的《中成藥通用名稱命名技術(shù)指導(dǎo)原則》更名為益肝消癥方。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體重(267.2±8.7)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，給予大鼠維持飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，以上方案報(bào)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。

1.2 主要藥品及試劑 益肝消癥方：主要由柴胡、黃芪、山藥等組成，藥物免煎顆粒由培力(南寧)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1401138；4%多聚甲醛(索萊寶公司，貨號(hào)：P1110)；HE 染色試劑盒(索萊寶公司，貨號(hào)：G1120)；Masson三色試劑盒(索萊寶公司，貨號(hào)：G1340)；B細(xì)胞淋巴瘤-2單克隆抗體(Bcl-2，Abcom公司，貨號(hào)：ab59348)；Bax單克隆抗體(CST公司，貨號(hào)：#14796)；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(Vazyme公司，貨號(hào)：R401-01)；AceQ?qPCR SYBR? Green Master Mix(Vazyme公司，貨號(hào)：Q121-02/03))；GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶(promega公司，貨號(hào)：A5003)。

1.3 主要儀器 自動(dòng)病理脫水機(jī)(萊卡公司)；包埋機(jī)(萊卡公司)；病理組織切片機(jī)(萊卡公司)；Biorad CFX96 qPCR 儀(Bio-rad公司)；NanoDrop微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司)；超純水儀(Millipore公司)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 公司)；光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯公司)。

1.4 動(dòng)物分組、造模、給藥及取材方法

1.4.1 分組及造模方法 40只Wistar雄性大鼠按照Excel隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組10只、模型組15只、益肝消癥組15只，飼養(yǎng)于室溫20～23℃，相對(duì)濕度55%～70%，12 h光照、12 h黑暗交替環(huán)境各組大鼠自由攝食攝水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。除對(duì)照組外，其余各組大鼠按照文獻(xiàn)[12,13]，以DEN 50 mg/kg劑量腹腔注射，對(duì)照組大鼠予0.4 ml /100 g 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，1次/周，持續(xù)14周。

1.4.2 給藥方法 造模第8周開(kāi)始灌胃給藥，對(duì)照組與模型組大鼠給予0.9%生理鹽水，按照1 ml/100 g劑量灌胃，1次/d；益肝消癥組大鼠按照臨床用量的6.25倍，按臨床60 kg成人用量進(jìn)行計(jì)算。具體藥量：將本方免煎顆粒溶解于0.9%生理鹽水中，每毫升含顆粒藥量為0.448 g，按1 ml/100 g劑量灌胃，1次/d。于第14周末取材，觀察肝臟外形變化，取肝臟組織，4%多聚甲醛固定用于病理切片，剩余肝臟組織置于液氮中保存。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 肝組織病理學(xué)檢查 取出固定好的組織，切大小1 cm×1 cm×1 cm長(zhǎng)方形組織，將組織放入包埋框，貼好標(biāo)簽，在自動(dòng)病理脫水機(jī)中進(jìn)行脫水、透明、浸蠟處理，石蠟包埋，以4 μm厚度切肝臟組織切片，展片、脫蠟，蘇木素浸泡5 min染細(xì)胞核，自來(lái)水沖洗1 min終止染色，1%鹽酸酒精溶液分化5 s，自來(lái)水洗返藍(lán)25 min，伊紅染色2 min，常規(guī)脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，晾干后顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.2 q-PCR法檢測(cè)Bcl-2、Bax mRNA表達(dá) TRIZOL法從大鼠肝臟中從提取總RNA，以GADPH作為內(nèi)控基因。大鼠引物序列如下。rat-bcl2-F：GTACCTGAACCGGCATCTG；rat-bcl2-R：GGGGCCATATAGTTCCACAA；rat-bax-F：GGGGAAAGGCATTT-TTCTTACT；rat-bax-R：CCTGAGGTTTATTGGCACCT；GAPDH-F：TCATTGACCTCAACTACATGG；GAPDH-R：TCGCTCCTGGAAG-ATGGTG。取2 μg RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；將cDNA作為模板進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為初始熱激活95℃ 2 min，變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min。

1.5.3 Western-Blot檢測(cè)肝組織Bcl-2、Bax、CytC蛋白表達(dá) 用裂解液提取肝臟組織總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)平蛋白濃度后取等量蛋白用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% SDS-PAGE進(jìn)行分離，半干法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，用脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入適宜濃度一抗(Bcl-2、Bax單抗?jié)舛确謩e為1∶1 000、1∶1 500)，4℃封閉一抗過(guò)夜，第二天加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h后，滴加顯影劑，凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及體重變化 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組大鼠一般狀況良好。模型組大鼠自腹腔注射DEN第4周開(kāi)始出現(xiàn)毛色枯皺，活動(dòng)下降，易激惹，攝食、飲水減少，尿黃，體重增加緩慢，第14周有4只死亡。益肝消癥組大鼠一般狀態(tài)好于模型組，第14周時(shí)有2只死亡。第7周之前益肝消癥組大鼠平均體重(354.2±24.37)g，低于模型組的(362.6±24.02)g，第14周時(shí)益肝消癥組大鼠平均體重(375.1±23.75)g，略高于模型組的(368.2±18.76)g，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組大鼠肝臟病理情況 對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞索放射狀排列，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染，核圓形居中，匯管區(qū)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膽汁瘀積。模型組大鼠可見(jiàn)廣泛纖維間隔分割與假小葉形成，肝細(xì)胞變性與增生病變并存，變性主要為肝細(xì)胞的小滴脂變、細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞壞死，同時(shí)出現(xiàn)肝細(xì)胞核深染，增生病變表現(xiàn)為大量肝細(xì)胞外基質(zhì)增生及細(xì)胞異型增生灶，肝細(xì)胞大小不等，細(xì)胞核增大，核/漿增高，核具有多形性，雙核、多核多見(jiàn)。益肝消癥組大鼠肝硬化、肝細(xì)胞異常增生程度輕于模型組(圖1)。

圖1 各組大鼠肝臟病理圖(HE，×100)

2.3 各組大鼠肝臟Bcl-2、Bax mRNA表達(dá) 與對(duì)照組相比，模型組大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.01、P<0.05)；益肝消癥組大鼠Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)，但低于模型組(P<0.05)，而B(niǎo)ax mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，明顯低于模型組(P<0.01)(圖2)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.4 各組大鼠肝臟Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 模型組、益肝消癥組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；模型組大鼠Bax蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，益肝消癥組大鼠Bax蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，低于模型組(P<0.05)(圖3)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3 討論

肝癌前病變多數(shù)情況下是發(fā)生在肝纖維化、肝硬化微環(huán)境基礎(chǔ)上的肝細(xì)胞異常增生，是肝癌發(fā)生前奏與防治的重要階段?，F(xiàn)仍缺乏針對(duì)肝癌前病變的動(dòng)物模型，影響對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。為此，團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)比已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)大鼠模型，參考徐靜、Park等[12,13]造模方法，應(yīng)用DEN 50 mg/kg腹腔注射形成肝癌前病變[14]。本法較符合肝癌前病變的形成過(guò)程，簡(jiǎn)便、安全，且結(jié)果穩(wěn)定，可作為化學(xué)誘導(dǎo)肝癌前病變的動(dòng)物模型。

前期研究動(dòng)態(tài)觀察DEN致大鼠肝癌前病變的模型發(fā)現(xiàn)，造模第8周時(shí)大鼠出現(xiàn)肝纖維化病變，本次實(shí)驗(yàn)為更加貼近臨床實(shí)際，于造模第8周開(kāi)始給予益肝消癥方干預(yù)，第7周時(shí)益肝消癥方組大鼠平均體重低于模型組，第8周后，益肝消癥方組大鼠平均體重逐漸上升，至14周時(shí)已略高于模型組，且一般狀態(tài)、死亡只數(shù)優(yōu)于模型組，逐漸體現(xiàn)出益肝消癥方對(duì)肝癌前病變大鼠一般狀況的改善作用。

比較各組大鼠肝組織病理變化可見(jiàn)，模型組大鼠肝細(xì)胞多處變性、壞死，在肝硬化基礎(chǔ)上形成以細(xì)胞核增大、核/漿增高及細(xì)胞核具有多形性為特點(diǎn)的異型增生灶，益肝消癥組大鼠肝硬化程度、肝臟細(xì)胞變性與壞死程度輕于模型組，但對(duì)肝癌前病變纖維化的改善略差于我們預(yù)防性給予益肝消癥方的前期研究[11]。

細(xì)胞凋亡的主要途徑有死亡受體途徑和以線粒體為主的內(nèi)源性凋亡，線粒體信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起著重要的作用[7]。線粒體凋亡途徑由促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的兩類基因共同控制，目前研究聚焦于Bcl-2家族。Bcl-2家族包括：①凋亡促進(jìn)基因，如Bax、Bad、Bak等；②以Bcl-2為代表的凋亡抑制基因。正常細(xì)胞中Bax主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，受到損傷刺激后，Bax直接或間接的在線粒體上形成孔道引起細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)cl-2 則在線粒體外膜發(fā)揮作用，以維持膜的完整性。當(dāng)Bax相對(duì)量高于Bcl-2時(shí)，Bax同源二聚體的數(shù)量增多，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bcl-2相對(duì)量高于Bax時(shí)，Bcl-2-Bax異源二聚體、Bcl-2同源二聚體數(shù)量增多，抑制細(xì)胞凋亡，Bax與Bcl-2的比例(Bax /Bcl-2)是決定其對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素[13]。

肝細(xì)胞約占肝臟細(xì)胞總量的80%，數(shù)量最多，功能重要[15]，肝細(xì)胞凋亡是誘發(fā)肝臟損傷以及肝臟疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]，當(dāng)肝臟受到物理、化學(xué)、生物等因素的刺激后，引起促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加來(lái)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，凋亡的肝細(xì)胞形成凋亡小體，后者可被HSC吞噬，引起HSC活化、增殖[17]。HSC被激活，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)堆積，后者是構(gòu)成腫瘤間質(zhì)的主要成分，并促進(jìn)正常肝細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變，逐漸形成肝癌前病變；同時(shí)，當(dāng)肝細(xì)胞大量受損，為促進(jìn)肝臟修復(fù)，肝細(xì)胞通過(guò)有絲分裂加速增殖，細(xì)胞更新周期加快，易發(fā)生DNA突變，肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變或肝干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝癌前細(xì)胞，促細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)象變化、硬度增加[18]。通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞、抗肝細(xì)胞凋亡，減少凋亡小體形成，從而減少HSC激活、癌前細(xì)胞生成，可為干預(yù)肝癌前病變提供一定研究基礎(chǔ)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[17,19,20]，肝纖維化的嚴(yán)重程度與肝細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá)呈顯著正相關(guān)與Bcl-2的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，中藥可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax表達(dá)或Bax/Bcl-2比值，保護(hù)肝細(xì)胞，抑制HSC活化，發(fā)揮改善肝纖維化的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠肝臟Bax表達(dá)較對(duì)照組升高，提示DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌前病變，引起促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加來(lái)誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)HSC活化、增殖，益肝消癥方通過(guò)降低大鼠肝臟Bcl-2、Bax mRNA、Bax蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比例發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝細(xì)胞凋亡，從而抑制HSC活化、增殖，減少癌前細(xì)胞增生，發(fā)揮干預(yù)大鼠肝癌前病變的作用，與我們前期實(shí)驗(yàn)對(duì)益肝消癥方作用特點(diǎn)的初步觀察相符[11]。