迪力甫沙·地力木拉提 馬重陽 張秋云

首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室 (北京， 100069)

錢英教授是全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承指導(dǎo)教師，全國名中醫(yī)，首都國醫(yī)名師。錢老結(jié)合臨床經(jīng)驗擬定截斷逆挽方治療慢加急性肝衰竭(ACLF)的療效已被多項實驗與臨床研究證實[1-3]。截斷逆挽方中融合的治法為截斷法(清熱解毒、涼血化瘀)和逆挽法(健脾益氣、滋補肝腎)，由葉下珠、瓜蔞、金錢草、生黃芪、槲寄生、三七、莪術(shù)、丹參、生地黃、黑附片10味藥組成，對應(yīng)了ACLF本虛標實的基本病機，是臨床治療該病的代表方[4]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分別比較截斷逆挽方中截斷法和逆挽法藥物的活性成分與靶點信息，探討截斷法和逆挽法在ACLF治療中的潛在生物學(xué)內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 截斷逆挽方活性成分的收集與篩選 本研究利用TCMSP平臺并檢索pubmed數(shù)據(jù)庫收集截斷逆挽方的所有成分，設(shè)置藥物成分的OB↑≥30%，DL↑≥0.1，CACO-2↑≥0作為條件篩選截斷逆挽方的活性成分。

1.2 截斷逆挽方活性成分作用靶點的收集 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取截斷逆挽方中篩選出的每個活性成分對應(yīng)的潛在靶點信息，并將不同來源的靶標在UniProt(http://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫中檢索，得到所有靶點的基因名，用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

1.3 截斷逆挽方活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 研究將截斷逆挽方中10味藥分截斷組和逆挽組展開研究，其中截斷組藥物有清熱解毒、涼血化瘀的功效，包含葉下珠、瓜蔞、金錢草、莪術(shù)、丹參、三七、生地7味藥；逆挽組藥物有健脾益氣、滋補肝腎的功效，包括生黃芪、槲寄生、黑附子3味藥。利用Cytoscape 3.6軟件構(gòu)建截斷逆挽方活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對活性成分進行分類注釋，分為截斷組成分、逆挽組成分和兩組共有成分3個類型。

1.4 截斷逆挽方靶點參與生物學(xué)過程的富集分析 用DAVID數(shù)據(jù)庫對上述相互作用網(wǎng)絡(luò)中靶點進行生物學(xué)過程的富集分析，初步得到截斷逆挽方全方抗ACLF的作用特點。

1.5 截斷法和逆挽法靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用String數(shù)據(jù)庫，對截斷逆挽方中截斷組藥物活性成分對應(yīng)靶點和逆挽組藥物活性成分對應(yīng)靶點分別進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析，分別構(gòu)建兩個PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape3.6插件Network Analyzer計算節(jié)點度，評價靶點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。

1.6 截斷法和逆挽法靶點KEGG信號通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫，對截斷逆挽方中截斷組藥物活性成分對應(yīng)靶點和逆挽組藥物活性成分對應(yīng)靶點分別進行KEGG信號通路分析，比較兩組富集到的生物信號異同。

2 結(jié)果

2.1 截斷逆挽方的活性成分與靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 研究經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫及文本檢索后進行OB值和DL值篩選，得到了截斷逆挽方的藥物活性成分，其中葉下珠8個，瓜蔞14個，金錢草8個，莪術(shù)3個，丹參67個，三七9個，生地黃3個，生黃芪24個，槲寄生7個，黑附子17個。去除重復(fù)成分后，截斷組藥物共有88個活性成分，逆挽組藥物共有32個活性成分，兩組之間存在6個共有成分。利用Cytoscape軟件構(gòu)建截斷逆挽方活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含254個節(jié)點，2 191條邊(見圖1)。網(wǎng)絡(luò)中可觀察到有76個活性成分作用在PTGS2靶點上，69個活性成分作用在NOS2靶點上，61個活性成分作用在GSK1B靶點上，這些活性成分在截斷組和逆挽組均有分布，表明截斷組藥物成分和逆挽組藥物成分在不同靶點上均具有一定的協(xié)同作用。

圖1 截斷逆挽方成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 截斷逆挽方靶點參與的生物學(xué)過程富集 研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫對截斷逆挽方相關(guān)靶點進行生物學(xué)過程的富集分析，發(fā)現(xiàn)截斷逆挽方可能參與了多條與ACLF相關(guān)的生物學(xué)過程，以P值排序，排名前10 的生物學(xué)過程分別是對缺氧的反應(yīng)、正調(diào)控細胞增殖、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、誘導(dǎo)MAPK活性、血小板激活、細胞增殖、細胞對脂多糖的反應(yīng)、負調(diào)控凋亡過程、正調(diào)控活性氧的代謝過程等(表1)。

表1 截斷逆挽方靶點參與的生物學(xué)過程

2.3 截斷逆挽方靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用String數(shù)據(jù)庫，我們對截斷法和逆挽法的藥物相關(guān)靶點進行PPI分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，分別得到了包含145個節(jié)點，1 484條邊和129個節(jié)點，1 240條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)。拓撲分析以Degree值排序，截斷法與逆挽法藥物PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前5的靶點均為IL6(67/63)、VEGFA(62/58)、TP53(59/56)、TNF(58/56)、MAPK1(57/55)。此外研究發(fā)現(xiàn)，同一靶點在兩個PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要性也有不同，如在PPI網(wǎng)絡(luò)中BCL2排序兩者相差30，THBD排序則相差21，TOP2A排序相差17。

2.4 截斷法、逆挽法藥物靶點KEGG信號通路分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對截斷法藥物靶點和逆挽法藥物靶點分別進行KEGG信號通路分析，以探討這些藥物的潛在生物學(xué)內(nèi)涵。結(jié)果顯示截斷法、逆挽法的靶點可在相同的KEGG信號通路中顯著富集，這些信號通路可能是截斷逆挽方抗ACLF的藥理機制(表2)。這些信號包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、TNF信號通路(TNF)、HIF-1信號通路(HIF-1)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt)、縫隙連接、乙型肝炎、雌激素信號通路、T細胞受體信號通路、甲狀腺激素信號通路、NOD樣受體信號通路、VEGF信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、細胞色素P450對異生素的代謝、丙型肝炎、Toll樣受體信號通路、細胞周期、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、B細胞受體信號通路。此外，我們還發(fā)現(xiàn)一些不重合的信號，如截斷法藥物與P53信號通路相關(guān)，逆挽法藥物與PPAR信號通路相關(guān)。

表2 截斷法、逆挽法藥物靶點共同參與的KEGG信號通路

3 討論

2019年《慢加急性肝衰竭中醫(yī)臨床指南》提出截斷逆挽法是搶救肝衰竭成功的關(guān)鍵治法。截斷法包括清熱解毒、涼血化瘀、通腑等，逆挽法包括滋肝、健脾、溫陽、補腎等。錢英教授將截斷法和逆挽法相結(jié)合創(chuàng)制截斷逆挽方治療慢性重型肝炎，療效較好[3]。本團隊在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，截斷逆挽方能夠降低慢加急性肝衰竭大鼠的死亡率、血清轉(zhuǎn)氨酶水平，抑制血清炎癥因子水平、細胞凋亡并促進細胞代償性增殖[5-9]，其具體藥理機制可能涉及E2F1、JNK及線粒體凋亡等多個信號。

本研究發(fā)現(xiàn)截斷逆挽方中截斷法和逆挽法藥物有6個活性成分的重合，共對應(yīng)118個靶點，占全方活性成分對應(yīng)靶點的77.63%，表明從活性成分的角度解讀截斷法和逆挽法并非絕對保守。同時，全方成分在不同的靶點上具有協(xié)同作用， PTGS2、NOS2、NOS3均與氧化應(yīng)激有關(guān)。臨床研究顯示，ACLF患者會出現(xiàn)系統(tǒng)性的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這種現(xiàn)象可被檢測循環(huán)中白蛋白的氧化還原狀態(tài)所證實[10]。因此我們認為截斷逆挽方可能具有抗氧化的藥理活性。有學(xué)者提出“三重打擊學(xué)說”闡釋肝衰竭的發(fā)病機制，即肝組織在肝衰竭發(fā)生過程中依次經(jīng)受了免疫損傷、缺血缺氧和內(nèi)毒素血癥等三重打擊[11]。本研究顯示截斷逆挽方可正調(diào)控活性氧的代謝過程，對缺氧的反應(yīng)、正調(diào)控細胞增殖、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、負調(diào)控凋亡過程、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程也有顯著富集，說明截斷逆挽方在對抗肝衰竭的三重打擊中均具有一定的藥理活性。值得注意的是，有研究認為ACLF從發(fā)病到進展成肝衰竭之間有過渡時間窗，此階段以免疫應(yīng)答過激為主要免疫學(xué)特點，若給予積極有效的干預(yù)，部分患者病情可得到逆轉(zhuǎn)[10]，這與錢英教授提出的截斷法不謀而合。實際上，免疫細胞和細胞因子參與了ACLF的全過程，早期處于免疫過度激活狀態(tài)，造成肝組織免疫性損傷，并形成系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，隨后又處于抑制狀態(tài)，增加感染風(fēng)險，甚至出現(xiàn)膿毒血癥。因此，未來對于截斷逆挽方抗ACLF藥理作用的研究可圍繞免疫相關(guān)靶點展開。

本研究利用String數(shù)據(jù)庫對截斷法、逆挽法藥物靶點蛋白形成的PPI網(wǎng)絡(luò)進行研究，發(fā)現(xiàn)IL6、VEGFA、TP53、TNF、MAPK1等靶點在兩個PPI網(wǎng)絡(luò)中具有相近的拓撲排序，表明截斷法和逆挽法在某些方面具有協(xié)同作用。VEFGA與肝再生相關(guān)，IL6、TNF及MAPK1是炎癥反應(yīng)的重要活性分子，TP53與肝細胞凋亡相關(guān)，均具有抗ACLF的潛在作用。而BCL2、THBD和TOP2A在兩個PPI中重要程度有所差異，可能是理解截斷法和逆挽法各自特點的關(guān)鍵靶點。KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)截斷法和逆挽法在多條信號通路上具有協(xié)同作用，與免疫反應(yīng)相關(guān)，包括TNF信號通路、T細胞受體信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、B細胞受體信號通路等。對這些信號通路的調(diào)控能夠顯著影響肝衰竭的病情進展和病理進程，是治療ACLF的潛在治療靶點[12-15]。此外，截斷法、逆挽法藥物重合的信號通路還包括PI3K-Akt信號通路和細胞周期，前者能夠抑制肝細胞凋亡，后者與肝細胞增殖有關(guān)[16,17]。神經(jīng)活性配體-受體相互作用及神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)信號也被識別，對這些信號的調(diào)控可能改善ACLF相關(guān)的肝性腦病，保障大腦功能發(fā)揮正常。我們還發(fā)現(xiàn)了截斷法藥物的特有信號P53信號通路及逆挽法藥物的特有信號PPAR信號通路；截斷法中的17個藥物活性成分可與PPAR受體相互作用(γ型和δ型)，文獻支持截斷法藥物中的活性成分如槲皮素、常春藤皂甙元與PPAR-α、γ、δ型均存在一定程度的相互作用，活性成分異鼠李亭可與PPAR-α、γ型相互作用[18-21]。因此，截斷法藥物可能通過P53信號通路發(fā)揮抗凋亡作用，逆挽法可能具有多靶點作用于PPAR信號通路的作用，發(fā)揮維持脂質(zhì)代謝功能、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)大部分截斷逆挽方的化學(xué)成分口服利用度較低，因此中藥復(fù)方存在與腸道菌群相互作用的可能，通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮抗ACLF的藥理作用。這些均是本網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的局限，需要未來的實驗研究深入探討。