聶青和 龍振晝

空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院感染病科/全軍感染病診療中心，國家重點學(xué)科 (陜西 西安， 710038)

全世界大約有2.57億慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者，由于HBV感染目前仍無法獲得完全治愈，這些HBV感染者面臨嚴(yán)重肝病并發(fā)癥及肝癌的威脅，甚至導(dǎo)致每年超過88.7萬人死于HBV相關(guān)疾病。大約40%以上的肝細胞肝癌(HCC)與慢性乙型肝炎(CHB)有關(guān)，HCC在世界范圍內(nèi)的癌癥相關(guān)死亡率中排第2位。在HBV的治療方面，乙型肝炎疫苗對已經(jīng)存在的HBV感染沒有任何效果；被各國批準(zhǔn)用于CHB的抗病毒治療用藥則分為兩大類：一類是長效干擾素(PEG-IFN)，另外一類是口服的核苷(酸)類似物(NAs)。具體的用藥策略包括單藥或者聯(lián)合用藥，聯(lián)合用藥還包括藥物的序貫用藥。

現(xiàn)有的核苷(酸)類似物(NAs)藥物要達到完全抑制HBV復(fù)制這個目標(biāo)基本沒有什么問題。想要達到臨床治愈的目標(biāo)，在某些特定人群中使用PEG-IFN聯(lián)合NAs也已經(jīng)取得了比較滿意的效果，盡管各國報道的治愈率不太一致。而想要達到完全治愈，也就是徹底清除肝細胞內(nèi)的閉合、共價、閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的目標(biāo)，以目前的條件來看，幾乎是不可能的。正因為如此，即使成功地抑制了HBV復(fù)制的患者，仍然有發(fā)生HCC的風(fēng)險，特別是有肝硬化背景的患者。

1 HBV的生活史研究進展

HBV完整的生活史包括黏附、進入、脫殼、入核、cccDNA產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄、翻譯、衣殼化、病毒組裝和分泌等。對HBV生命周期的探索，尤其是在涉及到病毒的生源論、體內(nèi)平衡和cccDNA庫的更新等領(lǐng)域的認(rèn)識不足，是治愈CHB研究的主要障礙所在。

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，也有一些HBV理論研究的突破。比如，2012年發(fā)現(xiàn)的?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運多肽(NTCP)，是 HBV進入肝細胞所必須的受體，使人們樂觀地認(rèn)為治愈CHB的目標(biāo)不久就會實現(xiàn)[1]。NTCP和原代人肝細胞、人肝癌細胞系、瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞系、人誘導(dǎo)多能干細胞源性肝細胞樣細胞等可利用的系統(tǒng)，以及人源化小鼠一起，推動了多樣化細胞培養(yǎng)模式的發(fā)展，使完整的HBV復(fù)制周期的再現(xiàn)成為可能[2]。對HBV的生源論、體內(nèi)平衡和cccDNA轉(zhuǎn)錄模板衰減控制機制的系統(tǒng)研究信息，有助于找出cccDNA復(fù)制機制的薄弱環(huán)節(jié)，進而探索從感染細胞中清除HBV的方法。

HBV感染時的年齡與感染的慢性化密切相關(guān)。嬰兒期感染HBV的人，超過90%會由急性肝炎發(fā)展為終生的慢性病毒感染狀態(tài)；如果在成年期感染HBV，則有超過90%的人會因為強大的免疫反應(yīng)而清除感染的細胞，也可能產(chǎn)生中和抗體并提供長期的保護作用。

一旦HBV慢性感染狀態(tài)確定，患者就有發(fā)生慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌的風(fēng)險。慢性HBV感染的自然史通常包括5個階段：免疫耐受期(HBeAg陽性、高水平的血清HBV DNA、ALT正常和最輕微的組織病理改變)、免疫清除期(HBeAg陽性、逐漸下降的血清HBV DNA水平、ALT升高和增加的組織病理學(xué)改變)、免疫控制期(抗-HBe陽性、低水平的血清HBV DNA、ALT正常和最輕微的組織病理學(xué)改變)、變異HBV的免疫清除期(HBeAg陰性、ALT升高、加重的肝炎活動和高水平的血清HBV DNA)和恢復(fù)期(HBsAg陰性，伴或不伴抗-HBs陽性)。這5個階段的HBV復(fù)制水平、病毒抗原表達和肝臟的炎癥活動都是不一樣的，在治療的時候要采取不一樣的策略。

每年大約有1%的慢性HBV感染個體會發(fā)生HBsAg的自發(fā)轉(zhuǎn)陰，這為HBV感染的藥物和免疫控制提供了可能。然而，慢性和急性HBV感染狀態(tài)的康復(fù)并不意味著HBV的完全清除。因為這些人體內(nèi)仍然有少量cccDNA陽性的肝細胞長期存在，而這可能是會使一些免疫抑制個體最終發(fā)生HBV重新激活、復(fù)制[3]。

因此，如果要從感染的細胞中清除HBV的cccDNA，或者控制其表達，需要對cccDNA生源論和體內(nèi)平衡的機制有更進一步的認(rèn)識。

2 CHB治愈的策略

CHB的治愈是一個復(fù)雜的課題，因為這涉及到HBV感染的控制、HBV及其相關(guān)基因的清除，以及HBV相關(guān)肝病問題的解決。既往對CHB治愈的關(guān)注點主要集中在HBV感染的治愈，包括HBV的清除、控制病毒復(fù)制，以及誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)去清除感染HBV的細胞，從而防止HBV感染向其他健康細胞的擴散等。HBV感染治療的多種需求催生了多種治愈模式的概念。

2.1 治愈模式的概念

2.1.1 完全治愈 血清中檢測不到HBsAg，清除了體內(nèi)所有的HBV DNA(包括cccDNA和與肝細胞內(nèi)的基因整合的HBV DNA等)，完全治愈很難通過現(xiàn)有的檢測手段來確定。

2.1.2 臨床治愈 指持續(xù)的血清中HBsAg和HBV DNA檢測不到，伴或不伴乙肝表面抗體的產(chǎn)生，而肝細胞內(nèi)還存在低水平的cccDNA和與宿主基因整合的HBV DNA。

2.1.3 部分治愈 在一個有限的治療療程結(jié)束之后，體內(nèi)可以檢測到HBsAg，但是HBV DNA血清中持續(xù)檢測不到，生化和組織學(xué)改變恢復(fù)。

由于目前還不可能從所有感染HBV的肝細胞中清除cccDNA庫以及整合的HBV DNA，使得臨床治愈成為一個更為切實可行的治療目標(biāo)。

2.2 HBV治愈的相關(guān)研究領(lǐng)域 2019年，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)制定了新的“治愈”CHB的戰(zhàn)略計劃，強調(diào)要側(cè)重于3個關(guān)鍵領(lǐng)域的研究。

2.2.1 HBV的基礎(chǔ)研究 包括HBV的生物學(xué)、發(fā)病機制、免疫、再激活、傳播的病毒和宿主因素，以及與其他肝炎病毒合并感染的影響等。

2.2.2 開發(fā)共享的研究工具和資源 比如實驗設(shè)計、方法的開發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)化，動物模型的建立，疾病進展研究、母嬰傳播的過程和生物標(biāo)志物的檢測等。

2.2.3 改進治愈和預(yù)防CHB的策略 如阻斷HBV復(fù)制、誘導(dǎo)抗HBV免疫反應(yīng)、清除被HBV感染的細胞等。

3 CHB治療新藥進展

3.1 CHB新藥的臨床試驗 目前的抗病毒治療并不能治愈CHB，主要是因為cccDNA庫的持續(xù)存在，這種HBV的轉(zhuǎn)錄模板是病毒感染的過程中在肝細胞核內(nèi)形成的。現(xiàn)有的被批準(zhǔn)用于治療CHB的抗病毒藥物包括聚乙二醇干擾素-α(PEG-IFN α-2b, 1991和PEG-IFN α-2a, 2005)和6種核苷(酸)類似物，它們分別是拉米夫定(Lamivudine, 1998)、阿德福韋酯(Adefovir dipivoxil, 2002)、恩替卡韋(Entecavir, 2005)、替比夫定(Telbivudine, 2006)、替諾福韋(Tenofovir, 2008)、丙酚替諾福韋TAF(Tenofovir allafenamide, 2016)[4]。

以上是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的抗HBV藥物。美國以外，2017年韓國也曾上市一款乙型肝炎新藥馬來酸貝西福韋(Besifovir dipivoxil maleate, BSV)[5]，也是一種抑制HBV DNA多聚酶的藥物，研究認(rèn)為48周的用藥效果與替諾福韋相當(dāng)，但對腎和骨骼的安全性似乎更好。

其他研發(fā)中的藥物尚沒有一種進入Ⅲ期臨床試驗。HBV進入抑制劑Myrcludex B 和Morphothiadin、JNJ 56136379、ABI-H0731等衣殼抑制劑仍處于臨床Ⅱ期。干擾和破壞病毒RNA的小干擾RNA(Small interfering RNA, SiRNA)藥物如VIR-2218，能結(jié)合病毒mRNA而防止其翻譯成病毒蛋白的反義分子藥物如IONIS-HBVRx，HBsAg分泌抑制劑如REP 2139和REP 2165，單克隆抗HBsAg抗體GC1102和RIG-1/NOD-2興奮劑都處在Ⅱ期臨床試驗中，免疫調(diào)節(jié)劑如Toll樣受體興奮劑、細胞凋亡-1抑制劑和一些治療性的疫苗也在用于增強固有和適應(yīng)性免疫以控制HBV感染，目前還處在臨床Ⅰ期。目前，一些臨床試驗也在評估聯(lián)合治療的協(xié)同或額外效果[6]。

2020年8月，國際乙型肝炎基金會(Hepatitis B foundation)網(wǎng)站更新了CHB新藥的進展，盡管沒有太大的突破，但是CHB新藥的研究還是有一些好的消息。比如3個CHB新藥的出現(xiàn)：治療性疫苗VTP-300進入臨床Ⅰ期，新型肽段GV1001和口服微生物組藥物CP101進入臨床前研究。部分新藥研究也有一定的進展，如衣殼抑制劑ABI-H2158進入臨床Ⅱ期，治療性疫苗VBI-2601從臨床前研究進入臨床Ⅰb/Ⅱa期研究，第二代衣殼抑制劑ABI-H2158和RNAi藥物JNJ3989(ARO-HBV)均進入臨床Ⅱ期研究。雖然還未有新藥進入CHB臨床Ⅲ期研究，但未來可期，新藥聯(lián)合現(xiàn)有藥物——NAs和PEG-IFN α的研究仍在繼續(xù)，一些高臨床治愈率的進展預(yù)示著新老藥聯(lián)合的可行性，相信不久的將來，全面臨床治愈時代將會來臨[7]。

3.2 乙型肝炎新藥的分類

3.2.1 直接抗病毒藥 直接抗病毒藥(Direct-acting antivirals, DAAs)的作用原理主要是靶向病毒并干擾HBV復(fù)制過程，包括干擾和破壞病毒RNA的沉默RNA類藥物(siRNAs)、干擾HBV進入肝細胞的進入抑制劑、干擾HBV DNA蛋白形成的衣殼抑制劑、干擾HBsAg產(chǎn)生的HBsAg抑制劑，以及與病毒mRNA結(jié)合以防止病毒蛋白形成的反義RNA藥物等。

3.2.2 間接抗病毒藥物 設(shè)計原理主要是靶向人體的免疫系統(tǒng)，來誘導(dǎo)免疫細胞、細胞因子等來攻擊HBV。曾經(jīng)最熱門、一直被人們寄予厚望的治療性疫苗就屬于這一類藥物，這是把疫苗技術(shù)用作激活人體的免疫系統(tǒng)的一種治療理念；激活先天免疫系統(tǒng)的化合物如Toll樣受體激動劑，屬于先天性的免疫防御途徑；而誘導(dǎo)程序性細胞死亡(凋亡)的化合物，則屬于宿主作用的治療途徑[8]。此外，還有基因編輯在藥物設(shè)計上的應(yīng)用類藥物、HBsAg單克隆抗體、PD-L1及其抑制劑、T細胞免疫治療、MicroRNA、FXR激動劑、反義鎖核酸技術(shù)、新型肽段、核酸直接殺傷HBV感染細胞、口服微生物制劑等(表1)。

表1 目前經(jīng)批準(zhǔn)在研的各種乙型肝炎新藥(更新至2020年8月)

3.3 部分新藥簡介

3.3.1 ALN-HBV02(Vir-2218) VIR-2218為皮下注射藥物，是使用乙型肝炎在研全新靶點的RNAi技術(shù)，即RNA干擾類藥物，目前處于臨床Ⅱ期研究階段。歐洲肝病學(xué)學(xué)會(EASL)最近公布了兩項VIR-2218的研究進展。其中，臨床前研究顯示VIR-2218靶向HBV基因組的高度保守區(qū)域，在體外試驗中證實有針對HBV的泛基因型效應(yīng)。同樣，VIR-2218在AAV-HBV小鼠模型中顯示出有效、持續(xù)的抗病毒活性。這些數(shù)據(jù)將是VIR-2218用于治療HBV感染患者的有力證據(jù)。最新的摘要還同時公布了VIR-2218的在健康受試者身上進行的臨床Ⅰ期研究結(jié)果，研究顯示VIR-2218支持皮下注射給藥，在健康受試者中表現(xiàn)出良好的藥代動力學(xué)特性，目前正在進行評估VIR-2218對HBV感染患者的療效研究。

續(xù)表1

3.3.2 Hepcludex(Bulevirtide) Hepcludex是病毒進入抑制劑(原名Myrcludex B)，開發(fā)用于治療慢性HBV和丁型肝炎病毒(HDV)感染患者，該藥能抑制肝細胞表面的HBV/HDV受體NTCP，并防止再生細胞的感染和病毒在肝內(nèi)的傳播。2020年8月4日，德國MYR Pharmaceuticals生物技術(shù)公司宣布，歐盟委員會(EC)已授予其先導(dǎo)藥物Hepcludex(bulevirtide)在歐盟地區(qū)的有條件營銷授權(quán)(CMA)用于成人慢性HDV感染和代償性肝病的治療。此次CMA批準(zhǔn)是基于2個Ⅱ期研究(MYR202和MYR203)的結(jié)果，數(shù)據(jù)顯示Hepcludex治療丁型肝炎期間，顯著降低了病毒血癥并改善了肝功能，同時具有良好的耐受性和安全性。目前正在開展一項評估Hepcludex長期治療的Ⅲ期HDV研究，以及一項評估Hepcludex與聚乙二醇干擾素聯(lián)合應(yīng)用的Ⅱ期HDV研究，而用于CHB的研究則處于Ⅱ期臨床試驗中。

3.3.3 VTP-300 VTP-300是利用疫苗技術(shù)的異源初免-增強方案(heterologous prime-boost regimen)的病毒載體ChAdOx-MVA的3種全長HBV抗原，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的特異性免疫應(yīng)答，主動打破原有免疫耐受狀態(tài)，實現(xiàn)誘導(dǎo)應(yīng)答過程，從而清除體內(nèi)HBV。這是一種新型的HBV治療性疫苗，已顯示可在小鼠中誘導(dǎo)強大而廣泛的抗HBV CD8+和CD4+T細胞和抗體反應(yīng)。該藥臨床Ⅰ期首位受試者完成了用藥。

3.3.4 VBI-2601 VBI-2601是一種新型重組蛋白免疫治療候選藥物，目前正在進行對CHB的治療研究。該藥側(cè)重于誘導(dǎo)和維持廣泛有效的針對HBV的免疫力，通過多種關(guān)鍵作用機制靶向B細胞和T細胞免疫力的獨特潛力，包括中和HBV，通過Pre-S1免疫阻斷肝細胞感染，并能通過免疫介導(dǎo)的方式清除感染HBV的肝細胞。

3.3.5 ABI-H2158 第二代衣殼抑制劑ABI-H2158已進入臨床Ⅱ期研究，該藥物已于2020年5月21日完成登記。該藥臨床Ⅰ期研究結(jié)果顯示，ABI-H2158治療的受試者的HBV DNA和HBV RNA水平均有較快速的下降，該藥具有較強抗HBV活性，受試者均表現(xiàn)出對ABI-H2158較好耐受性。

3.3.6 GV1001 GV1001是一種新型肽段，是抗原提呈細胞的樹突狀細胞把外來肽(GV1001)通過吞噬細胞作用引入到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)經(jīng)過溶酶體的溶酶作用而分解。這時，被樹突狀細胞的MHC受體分解的肽的一部分提呈在T細胞上，提呈過程是通過MHC受體和T細胞受體(T cell receptor, TCR)相結(jié)合的過程中形成。被樹突狀細胞提呈的抗原(GV1001)可誘發(fā)T細胞的活性和增殖，被激活的T細胞在血液循環(huán)中識別癌組織的癌細胞中高表達的端粒酶，并選擇性地清除癌細胞。GV1001除了癌癥以外，在前列腺增生癥及阿爾茨海默病等多種適應(yīng)證中證明了抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)激素作用等附加效果。

3.3.7 CP101 CP101是一種研究性口服微生物組藥物，最初旨在預(yù)防復(fù)發(fā)性復(fù)雜梭菌感染(rCDI)，目前也在評估其治療慢性HBV感染的能力。CP101旨在恢復(fù)微生物組的組成和功能。有研究表明，微生物組功能障礙可能會介導(dǎo)CHB，多項獨立的臨床研究表明，微生物群移植可清除長期抗病毒治療后HBeAg仍為陽性的CHB患者中活躍的HBV。

3.3.8 IMC-I109V 基于T細胞受體(T cell receptor，TCR)改造的ImmTAC平臺，ImmTAC全稱Immune mobilising monoclonal TCRs Against Cancer，即抗腫瘤免疫激動單克隆T細胞受體，它本質(zhì)上屬于一類新型的雙特異性生物大分子，是由工程化改造的TCR以及抗CD3的scFv組成。在傳染病方面，該公司將其TCR技術(shù)平臺應(yīng)用于病毒或細菌(ImmTAV或ImmTAB)，IMV-I109V即對應(yīng)的CHB的相關(guān)新藥。EASL2020最新摘要公布了該藥臨床前研究的研究進展，結(jié)果顯示ImmTAV分子可有效、特異性地消除感染HBV的細胞。其中主要的ImmTAV分子——IMC-I109V現(xiàn)已通過臨床前研究數(shù)據(jù)支持首次人體試驗。這些數(shù)據(jù)提供了新穎的免疫治療策略的證據(jù)，該策略旨在為慢性HBV感染患者實現(xiàn)快速的功能性治愈。

4 CHB治愈的思考

在一項對黑猩猩的研究中顯示，在急性HBV感染的自愈過程中，盡管同時也有非細胞途徑參與清除HBV，但幾乎所有感染的肝細胞均能被CD8+T細胞所清除。通常只有小部分感染HBV的細胞會最終存活下來，但感染之后所產(chǎn)生的抗HBs能夠防止新的細胞繼續(xù)感染。類似的機制幾乎自然地發(fā)生在每年成千上萬的急性HBV感染人類當(dāng)中[9]。這種HBV清除的狀態(tài)，目前還沒有可以利用的治療方法能夠在慢性HBV感染患者當(dāng)中實現(xiàn)。這個結(jié)果提示，治療HBV感染不一定需要完全清除病毒才能夠獲得長期的病毒控制。

盡管如此，治愈性的HBV治療藥物對慢性HBV感染者來說，可能是達到理想目標(biāo)的更好辦法。如果能誘導(dǎo)出類似于急性HBV感染或部分慢性HBV感染自愈患者的類似反應(yīng)，對于患者來說，或許是一個更安全的治療策略。

對于CHB的治愈，cccDNA的清除是最直接和有效的策略。目前的抗病毒藥即使長期服用，也不能清除cccDNA，甚至在體外試驗和動物模型中都無法做到。通過對細胞因子水平的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，α干擾素可誘導(dǎo)APOBEC依賴的HBV DNA脫氨基作用，這引發(fā)了是否能導(dǎo)致cccDNA持續(xù)減少的關(guān)注[10]。而使用CRISPR/Cas9或其他基因編輯的方法直接靶向cccDNA，在實驗研究中顯示出有前途的結(jié)果，但如何精準(zhǔn)定位肝細胞、靶向失敗后的效應(yīng)，如何避免等問題，依然讓人擔(dān)心一些不可預(yù)料的后果[11]。這些風(fēng)險和困難的存在，使得靶向病毒或宿主蛋白的方法在影響cccDNA的形成、穩(wěn)定和表達等方面，仍然需要進一步研究。目前基礎(chǔ)研究的進展使得了解HBV完整的復(fù)制過程成為可能。我們認(rèn)為這些成果將有助于CHB的治愈，而cccDNA的清除可能是唯一有潛力達到安全、持久的HBV感染治愈的策略。