杜 偉，黃文濤，羅金萍，占敏霞，羅先欽，何白英，張 莉

1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065； 2. 重慶南郊醫(yī)院，重慶 400055

慢性變應性接觸性皮炎為皮膚科常見病、多發(fā)病，是因長期反復接觸某一弱刺激性、低濃度致敏物質引起的皮膚炎癥．在接觸部位呈現(xiàn)紅斑、水腫等炎性表現(xiàn)，病理可觀察到炎細胞浸潤，因此認為炎細胞的募集在變應性接觸性皮炎的發(fā)病與進展中占主導地位．臨床實踐中，抗炎是治療變應性接觸性皮炎的有效方法之一．中藥四季青在一些研究中被證實具有良好的抗炎作用[1-2]，亦被配伍用于接觸性皮炎的治療[3]，《中國藥典》(2015版)提示無毒性，因此四季青成為治療慢性變應性接觸性皮炎的待試藥物．

皮膚是保護體內器官免受外界環(huán)境有害物質刺激的重要生理屏障，當受到外界因素刺激時，能分泌多種炎癥因子以積極參與局部甚至全身炎癥反應．長期反復接觸2，4-二硝基氟苯(DNFB)可引起表皮損傷，肉眼可見紅斑、水腫等炎性損傷的體征，多種細胞因子異常表達共同影響其發(fā)生、發(fā)展和轉歸[4]，如白細胞介素18(IL-18)、白細胞介素1β(IL-1β)等．也有研究指出，黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)的高表達是慢性接觸性皮炎反復發(fā)作的機制之一[5]．AIM2/半胱氨酸蛋白酶(Caspase-1)組成炎癥小體，分泌炎性因子IL-1β，IL-18．故本課題擬基于四季青的抗炎作用和AIM2炎癥小體信號通路的特征，觀察四季青水提液對DNFB誘導大鼠慢性變應性接觸性皮炎的治療作用及作用機制．

1 材 料

1.1 受試藥物

四季青飲片購自重慶市中藥研究院門診部．稱取2 kg四季青飲片，加入純化水10 000 mL，浸泡30 min后加熱至100 ℃回流提取2 h，趁熱過濾，收集濾液9 200 mL，殘渣加入9 000 mL純化水，采用同樣方法，收集第2次濾液8 700 mL，合并2次濾液共計約17 900 mL，采用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至1 390 mL，得生藥約1.44 g/mL(以長梗冬青苷計不低于10.41 mg/g)，分裝后-20 ℃冷凍保存．

1.2 試劑與儀器

DNFB，東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)； 丙酮，重慶川東化工有限公司生產(chǎn)； 大鼠IL-1β，IL-18 ELISA檢測試劑盒，均購于Shanghai Jinjin Chemistry Technology Co.，Ltd； AIM2，Caspase-1一抗及羊抗兔二抗均購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司； ST360酶標儀，上海科華實驗系統(tǒng)有限公司； Mass2000圖象處理系統(tǒng)，四川大學圖象處理國家研究所； 熒光定量PCR儀，BIOER公司．

1.3 動 物

SD大鼠，SPF級，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(渝)2017-0003．在溫度為20～26 ℃、相對濕度為40%～70%的飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)，使用許可證號為SYXK(渝)2017-0004．實驗中對動物的處置符合動物倫理學要求．

2 方 法

2.1 制備模型

SD大鼠(雌雄各半，體質量180～220 g)檢疫及適應性飼養(yǎng)后，參照文獻[6]脫毛、DNFB致敏，2周后DNFB激發(fā)，每周激發(fā)1次，共4次，大鼠背部可見明顯紅斑、水腫、結痂、抓痕、鱗屑，即得到慢性變應性接觸性皮炎模型．另8只大鼠(正常大鼠)不作處理．

2.2 分組及藥物干預

選取造模成功大鼠32只，隨機區(qū)組法分為4組(每組8只)，即模型對照組，四季青水提液高、中、低劑量組(每公斤含生藥14.4 g，7.2 g，3.6 g)； 取正常大鼠8只設為正常對照組．各組灌胃給予相應受試藥物(正常對照組、模型對照組給予等體積純化水)，給藥體積10 mL/kg，每日1次，給藥周期14 d．

2.3 指標觀察及測定

各組動物于首次給藥前、治療7 d后、末次給藥后24 h(觀察終點)，肉眼觀察皮損情況，采用EASI評分方法[7]評分，考察癥狀包括紅斑、水腫、結痂，以癥狀總積分來判斷組間差異，尼莫地平法[8]計算各組總有效率； 造模前、首次給藥前、治療第7 d后、末次給藥后24 h，顳叢靜脈采集血液0.5 mL，3 000 r/min離心，取上清，ELISA檢測IL-18，IL-1β水平； 安樂處死大鼠后，迅速剪取造模局部皮膚，取0.2 g實時熒光定量PCR檢測皮損中AIM2，Caspase-1相對表達量，剩余造模局部皮膚組織以中性甲醛固定，HE染色，定性觀察組織病理改變，并對炎細胞數(shù)進行定量分析．

AIM2，Caspase-1相對表達量檢測方法： 使用Trizol總RNA提取試劑盒獲得皮損組織中的總RNA，逆轉錄為cDNA．AIM2引物序列： 上游5’-AAAGCCCAAAACTAAGGTG-3’，下游5’-TCTGCCATACTTATACCCTC-3’； Caspase-1引物序列： 上游5’-TAAATGGATTGCTGGATGAAC-3’，下游5’-TCGTGCCTTTTCCATAACAGT-3’； β-actin引物序列： 上游 5’-CCCATCTATGAGGGTYACGC-3’，下游 5’-TTAATGTCACGCACGATITC-3’．采用DBI三步法PCR擴增標準程序擴增40個循環(huán)，行熒光定量PCR，根據(jù)公式 2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量．

2.4 統(tǒng)計學處理

3 結 果

3.1 皮損評分結果

皮損癥狀積分結果及皮損療效總有效率見表1，觀察終點皮損局部情況見圖1．模型對照組治療7 d后、末次給藥后24 h與首次給藥前比較，差異無統(tǒng)計學意義．與模型對照組比較，在治療7 d后高劑量組皮損積分明顯降低，末次給藥后24 h中、高劑量組皮損積分均明顯降低； 至觀察終點，與模型對照組比較，中、高劑量組總有效率差異有統(tǒng)計學意義．

表1 皮損積分結果及總有效率

圖1 觀察終點大鼠皮損局部情況

3.2 組織病理學檢查結果

結果見圖2及圖3．定性觀察： 正常對照組動物皮膚組織結構正常，未見明顯病理變化； 模型對照組、低劑量組動物造模局部表皮真皮纖維組織增生和肉芽組織形成，炎性細胞浸潤累及皮下組織； 中、高劑量組動物造模局部表皮真皮纖維組織增生修復良好．定量分析： 與模型對照組比較，低、中、高劑量組炎細胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義．

圖2 四季青水提液對大鼠表皮病理變化的影響(HE×40倍)

與模型對照組比較，*表示p≤0.05，**表示p≤0.01， 差異有統(tǒng)計學意義．圖3 四季青水提液對大鼠皮膚炎細胞數(shù)的影響

3.3 對血清IL-18，IL-1β水平的影響

結果見表2和表3．造模前，模型對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組與正常對照組比較，各組血清IL-18，IL-1β水平差異均無統(tǒng)計學意義．首次給藥前，模型對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組與正常對照組比較，各組別血清IL-18，IL-1β水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義．治療7 d后，低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型對照組比較，高劑量組血清IL-18，IL-1β水平均下調，差異有統(tǒng)計學意義．末次給藥后24 h，低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型對照組比較，中、高劑量組血清IL-18水平下調，差異有統(tǒng)計學意義； 高劑量組血清IL-1β水平下調，差異有統(tǒng)計學意義．

表2 各組大鼠血清IL-18水平 pg·mL-1

表3 各組大鼠血清IL-1β水平 pg·mL-1

3.4 對大鼠皮損AIM2，Caspase-1相對表達量的影響

結果見表4．模型對照組與正常對照組比較，模型對照組AIM2，Caspase-1均過表達，差異有統(tǒng)計學意義．與模型對照組比較，通過四季青水提液干預后，高劑量組AIM2表達下調，差異有統(tǒng)計學意義．

表4 各組大鼠皮損AIM2，Caspase-1相對表達量

4 討論與結論

減少或避免致敏物質的接觸是根治慢性變應性接觸性皮炎的有效方法，這一方法操作起來并不現(xiàn)實，因一些過敏物質逐漸被發(fā)現(xiàn)而“隱性”存在于多種物品中，如紋身可致慢性變應性接觸性皮炎(色素降解產(chǎn)物致敏)[9]、牙醫(yī)接觸牙科材料致接觸性皮炎(樹脂改性玻璃離聚物致敏)[10]，因此藥物的篩選仍有意義．模型SD大鼠灌胃給予待篩藥物四季青水提液，在治療結束后可見中、高劑量組皮損積分較模型對照組顯著降低、總有效率較模型對照組顯著增加、炎細胞數(shù)較模型對照組明顯減少，表明四季青水提液對DNFB誘導慢性變應性接觸性皮炎大鼠炎性皮損有良好的改善作用．

炎癥小體是炎癥研究中的一個里程碑式的發(fā)現(xiàn)，其家族成員眾多，AIM2是其中的一員．AIM2可存在于細胞質和細胞核內，其N端含有熱蛋白結構域(PYD)，在C端為核苷酸/寡糖結合結構域，是HIN200家族的成員[11]．AIM2能夠特異性地識別細胞質當中變異或異位的DNA分子，包括受損的DNA分子以及由于細胞核核破裂而泄露在胞漿當中的DNA片段[12]．皮膚中的AIM2通過其PYD結構識別結合細胞漿DNA而激活，釋放炎癥因子．基因敲除和基因沉默AIM2后，發(fā)現(xiàn)促炎細胞因子的產(chǎn)生明顯減少，這表明AIM2對于炎癥因子的產(chǎn)生或釋放發(fā)揮重要作用[13]．在接觸性皮炎患者皮損中可檢測出AIM2表達的升高[14]，提示AIM2炎癥小體在慢性變應性接觸性皮炎中發(fā)揮了促炎作用．本研究模型對照組AIM2表達較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，模擬了慢性變應性接觸性皮炎AIM2異常的疾病過程．通過四季青水提液的干預，高劑量組較模型對照組AIM2表達顯著降低，表明四季青水提液對慢性變應性接觸性皮炎大鼠AIM2有抑制作用．

Caspase-1屬Caspase家族成員，是炎癥小體活化的必備“元件”．Caspase-1既被認為是IL-1β的轉化酶，也被認為其對IL-18的成熟分泌起關鍵作用，因此炎癥小體活化的最終結果是IL-18和IL-1β的剪切成熟[15]．IL-18，IL-1β同屬IL-1家族，IL-1細胞因子被認為是協(xié)調急性和慢性炎性疾病的第一個細胞因子家族[16]．IL-18參與Th1細胞活化，但也涉及產(chǎn)生Th2的γδT細胞和巨噬細胞活化[17]．IL-1β促進白細胞的浸潤、促進T細胞和B細胞的增殖分化等[17]．炎癥因子在炎癥反應中起著重要作用[18]，IL-18，IL-1β共同促進了炎癥反應，抑制這些炎性因子可減緩炎癥損傷．經(jīng)四季青水提液干預后，高劑量組較模型對照組IL-18，IL-1β水平明顯下調，表明四季青水提液對慢性變應性接觸性皮炎大鼠IL-18，IL-1β過表達有抑制作用．

綜上，本研究表明，四季青水提液對慢性變應性接觸性皮炎大鼠有治療作用，其機制可能是通過抑制AIM2/Caspase-1炎癥小體信號通路來實現(xiàn)的．