李夢潔, 謝金芳, 尹 碩, 劉 霞

（1. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院綜合口腔治療科，吉林 長春 130021；2. 河南省鄭州市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，河南 鄭州 450000；3. 吉林省長春市口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長春 130041）

牙髓組織受到外界刺激時，牙齒硬組織和軟組織釋放較低水平的炎癥性分子，可引起牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體產(chǎn)生類似于再生修復(fù)的反應(yīng)，通過上調(diào)P38 蛋白的信號傳導(dǎo)核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 途徑，使牙髓的炎癥反應(yīng)最小化，同時提供更有利的內(nèi)在環(huán)境，促使牙齒硬組織進行自身修復(fù)［1-3］。損傷的應(yīng)答和修復(fù)是一個復(fù)雜的生物過程，涉及多種因子介導(dǎo)的一系列細胞、蛋白和細胞因子間的級聯(lián)反應(yīng)，但其具體機制目前尚不清楚。

基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）作為MMPs 家族的重要成員，參與正常及病理性的組織形成［4-5］。MMP-3 在正常細胞和腫瘤細胞的遷移中作為非常重要的調(diào)控因子，在很多方 面 起 著 正 負 調(diào) 控 的 作 用［6-7］。DANIELS 等［8］研究發(fā)現(xiàn)：創(chuàng)傷后不同時間點創(chuàng)傷組織中均可見MMP-3 表達，直至損傷后28 d，提示MMP-3 不僅參與了細胞外基質(zhì)降解，也與細胞外基質(zhì)重塑和組織改建有關(guān)。研究［9］表明：MMP-3 在難愈創(chuàng)傷動物模型組織中呈高表達，有促進創(chuàng)傷修復(fù)的作用。結(jié)締組織生長因子2 （connective tissue growth factor 2，CCN2） 是CCN 家族成員之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種類型的細胞可以產(chǎn)生CCN2［10-11］，其在胚胎發(fā)育、骨折愈合、細胞增殖及分化、血管形成和腫瘤發(fā)生等方面均發(fā)揮重要的作用［12-13］。研究［14-15］顯示：MMP-3 和CCN2 在骨和軟骨的發(fā)生發(fā)展過程中有相互作用，體外研究也證實CCN2 在MMP-3 的誘導(dǎo)下可以促進牙髓細胞的增殖、遷移和血管的再生。但MMP-3 和CCN2 在牙髓損傷修復(fù)中的表達變化及其關(guān)系目前尚不明確。

本研究通過建立大鼠牙髓損傷模型，采用HE 染色和免疫組織化學(xué)染色法觀察MMP-3 和CCN2 在大鼠牙髓損傷修復(fù)過程的表達情況，以探討其在牙髓損傷修復(fù)過程中的可能作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器清潔級雄性8 周齡Wistar 大鼠28 只，體質(zhì)量180～200 g，購自吉林大學(xué)實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（吉） 2008-0011。10%EDTA 液和4% 多聚甲醛（北京恒業(yè)中遠化工有限公司），速眠新（吉林省華牧動物保健品有限公司），乙醚（長春市永輝化工商貿(mào)有限公司），兔抗大鼠MMP-3 多克隆抗體、兔抗大鼠CCN2 多克隆抗體、SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司），其他常規(guī)試劑均購于上?；瘜W(xué)試劑公司。1/4 鎢鋼球鉆（日本Mani 公司），高速渦輪機（上海醫(yī)用儀器設(shè)備廠），CX21 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），自制開口器。

1.2 牙髓損傷動物模型建立和標(biāo)本制備大鼠健康狀況良好，混合飼料喂養(yǎng)，自由飲水。將大鼠平均分為7 組，每組4 只，隨機選取一組為對照組，其余6 組分別為損傷后0 h 組、6 h 組、1 d 組、3 d 組、7 d 組和14 d 組。除對照組外，其余各組大鼠采用單純開放法制備上頜磨牙牙髓損傷模型：大鼠經(jīng)乙醚麻醉，肌注速眠新（0.2 mL·kg－1） 后取仰臥位，將四肢及上頜固定于手術(shù)板上。2%碘伏消毒口腔，用1/4 球鉆在大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙面開髓，透粉時停止操作，探針穿髓，生理鹽水沖洗，無菌棉球壓迫止血并干燥窩洞，此時造模成功［1］。所有窩洞制備由同一名經(jīng)驗豐富的臨床醫(yī)生單獨完成。術(shù)后大鼠正常環(huán)境飼養(yǎng)，分別在上述不同時間點將大鼠乙醚深度麻醉后固定四肢，打開胸腔暴露心臟，將針頭刺入左心室，剪開右心耳，以引出血液和灌流液。先用輸液器緩慢注入生理鹽水，直至流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛約30 min。待組織變硬立即斷頭，取上頜骨置于4%多聚甲醛溶液中48 h，經(jīng)10%EDTA 脫鈣10 周后，近遠中向修塊，脫水，透明，浸蠟，包埋，制備厚度為4 μm 連續(xù)切片。

1.3 HE 染色觀察大鼠牙髓組織病理形態(tài)表現(xiàn)選取通過穿髓點的切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色10 min，流水沖洗；1%鹽酸乙醇分化1～3 s，流水沖洗；氨水返藍5～10 s、0.5%伊紅溶液染色5 min，流水沖洗5 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察各組大鼠牙髓組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 的定位及蛋白表達水平選取通過穿髓點的切片在60℃干燥箱內(nèi)干燥3 d，使組織與玻片更密貼。切片在常溫下脫蠟至水，PBS 緩沖液沖洗3 min×3 遍，置于保濕盒中。室溫下滴加復(fù)合消化酶10 min，PBS 緩沖液沖洗3 min×3 遍；滴加3% H2O2去 離 子 水10 min，PBS 緩 沖 液 沖洗3 min×3 遍；滴加0.1%Tritonx-100 液10 min，PBS 緩沖液沖洗3 min×3 遍；滴加5%BSA 封閉液20 min 后甩掉；分別滴加兔抗鼠的多克隆抗體（武漢博士德），4℃冰箱過夜；滴加羊抗兔的二抗（北京中杉）20 min，PBS 緩沖液沖洗5 min×3 遍；滴加SABC 試 劑 常 溫20 min，PBS 緩 沖 液 沖 洗5 min×3 遍；滴加新鮮配置的DAB 顯色液鏡下顯色，水洗后蘇木素輕度復(fù)染，樹膠封片，鏡下觀察。陰性對照以PBS 緩沖液代替一抗。在高倍鏡下從每張切片的染色陽性區(qū)各隨機選取3 個不重疊區(qū)域，用Image-Pro Plus 6.0 軟件測其陽性區(qū)的平均吸光度（A） 值，并取均值代表MMP-3 和CCN2 蛋白表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用多因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠牙髓組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠牙髓組織中可見成牙本質(zhì)細胞層、乏細胞層、多細胞層和固有牙髓分界清楚；外層成牙本質(zhì)細胞呈柵欄狀排列緊密、整齊，內(nèi)側(cè)成纖維細胞排列均勻，呈星形，胞漿突起相互連接，間質(zhì)可見血管、纖維。損傷后0 h 組，大鼠牙髓組織中可見血管輕度擴張，其他無明顯變化。損傷后6 h 組，大鼠穿髓孔下方牙髓組織中可見成牙本質(zhì)細胞核固縮，胞體呈扁平狀排列，血管擴張明顯，可見散在炎癥細胞。損傷后1 d 組，大鼠牙髓組織中可見血管擴張及新生血管，穿髓孔下方牙髓乏細胞層消失，牙髓細胞生長活躍。損傷后3 d 組，大鼠穿髓孔下方牙髓組織中可見大量炎癥細胞聚集，血管新生明顯；炎癥下方成纖維細胞增殖明顯，呈星形；成牙本質(zhì)細胞排列紊亂。損傷后7 d 組，大鼠穿髓孔下方牙髓組織炎癥減輕，前期牙本質(zhì)明顯增厚，可見骨樣鈣化團塊出現(xiàn)，成牙本質(zhì)細胞排列紊亂，牙髓組織中可見大量增殖的星形細胞。損傷后14 d 組，大鼠開髓點下方有修復(fù)性牙本質(zhì)生成，較牙本質(zhì)密度低；牙髓組織中增殖細胞排列紊亂，可見少量炎癥細胞。見圖1。

2.2 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 的定位對照組大鼠牙髓組織中幾乎檢測不到MMP-3的表達。損傷后0 h 和6 h 組，MMP-3 在大鼠穿髓孔下方牙髓組織間質(zhì)中呈弱陽性表達。損傷后1 d組，MMP-3 在大鼠穿髓孔下方牙髓組織成牙本質(zhì)細胞及細胞間質(zhì)中呈陽性表達。損傷后3 d 組，MMP-3 在大鼠成牙本質(zhì)細胞中呈強陽性表達，在淋巴細胞和中性粒細胞只表達于胞核中，在增生的血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞胞漿中呈陽性表達。損傷后7 d 組，MMP-3 在大鼠牙髓組織鈣化團塊中無表達，而在其周圍細胞可見強陽性表達，此外在成牙本質(zhì)細胞和成纖維細胞的胞質(zhì)中呈強陽性表達。損傷14 d 組，MMP-3 在大鼠新形成的修復(fù)性牙本質(zhì)中無表達，在牙髓組織中的表達明顯減弱。見圖2。

對照組大鼠牙髓組織中幾乎檢測不到CCN2 的表達。損傷后0 h 和6 h 組，CCN2 在大鼠穿髓孔下方牙髓組織間質(zhì)中呈弱陽性表達。損傷后1 d 組，CCN2 在大鼠穿髓孔下方牙髓組織成牙本質(zhì)細胞及細胞間質(zhì)中呈陽性表達。損傷后3 d 組，CCN2 陽性表達細胞分布廣泛，集中于大鼠穿髓孔下方牙髓組織淋巴細胞、中性粒細胞和血管內(nèi)皮細胞的胞漿中。損傷后7 d 組，大鼠牙髓組織中鈣化團塊周圍可見CCN2 強陽性表達，增殖的成纖維細胞和星型細胞中也可見CCN2 強陽性表達，主要位于胞漿中，此外少量炎癥細胞中也可見CCN2 陽性表達。損傷后14 d 組，CCN2 在大鼠新形成的修復(fù)性牙本質(zhì)中無表達，在修復(fù)性牙本質(zhì)下方成牙本質(zhì)細胞中呈陽性表達，其表達較損傷后7 d 組減弱，胞核中未見CCN2 表達，細胞間質(zhì)中可見CCN2 弱陽性表達。見圖3。

圖1 各組大鼠牙髓組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of pulp tissue of rats in various groups（HE，×200）

2.3 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達水平與對照組比較，損傷后不同時間組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與損傷后0 h 組比較，損傷后6 h組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），損傷后1、3、7 和14 d 組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）。見表1。

圖2 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 蛋白表達情況（免疫組織化學(xué)，×200）Fig.2 Expressions of MMP-3 protein in pulp tissue of rats in various groups（Immunohistochemistry,×200）

圖3 各組大鼠牙髓組織中CCN2 蛋白表達情況（免疫組織化學(xué)，×200）Fig.3 Expressions of CCN2 protein in pulp tissue of rats in various groups（Immunohistochemistry,×200）

3 討 論

目前臨床上針對根尖孔未形成，因機械性、外傷或齲源性因素點狀露髓的年輕恒牙，以及根尖已完全形成的意外穿髓、穿髓孔直徑不超過0.5～1.0 mm 的恒牙，可以采用直接蓋髓術(shù)來保存活髓。常用蓋髓劑是氫氧化鈣和礦物三氧化物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA），其具有殺菌、滅活內(nèi)毒素和誘導(dǎo)硬組織形成等作用，但存在蓋髓點下方形成壞死硬化層和不能良好地還原牙髓活力等缺點［16-17］。已有研究［18-20］顯示：牙髓損傷后具有一定抵御刺激、進行自身修復(fù)的能力。牙髓干細胞可從深層牙髓組織向創(chuàng)傷表面遷移和增殖，并分化為成牙本質(zhì)樣細胞，進而形成修復(fù)性牙本質(zhì)，在此過程中，血管不斷地向組織供給營養(yǎng)及氧氣，排出代謝產(chǎn)物及廢物，維持干細胞和前體細胞的遷移及供給平衡［21-22］。該修復(fù)潛能是牙髓組織固有的一種生物學(xué)機能，也是臨床工作中牙髓活髓保存治療的理論基礎(chǔ)。牙髓干細胞遷移、增殖以及血管形成是牙髓修復(fù)的基礎(chǔ)，但此過程的分子學(xué)機制目前尚不清楚。

表1 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達水平Tab. 1 Expression levels of MMP-3 and CCN2 proteins in pulp tissue of rats in various groups （n=4，）

表1 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達水平Tab. 1 Expression levels of MMP-3 and CCN2 proteins in pulp tissue of rats in various groups （n=4，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with 0 h after injury group.

Group Control After injury 0 h 6 h 1 d 3 d 7 d 14 d MMP-3 0.078 8±0.005 4 CCN2 0.069 6±0.004 7 0.141 2±0.003 9*0.147 1±0.006 5*0.190 6±0.001 5*△0.272 1±0.005 1*△0.378 8±0.006 2*△0.236 8±0.010 1*△294.485＜0.01 FP 0.136 2±0.004 8*0.137 2±0.004 7*0.186 7±0.003 5*△0.265 9±0.007 8*△0.339 0±0.008 3*△0.224 7±0.003 8*△89.977＜0.01

MMP-3 和CCN2 是很好的促進創(chuàng)傷愈合的細胞因子，可以促進細胞的增殖、黏附和分化，對創(chuàng)面的愈合、血管和神經(jīng)的再生也有很強的促進作用。本研究采用單純開放法制備大鼠牙髓損傷模型，HE 染色顯示：牙髓損傷后1 d 可見血管擴張、新生血管；牙髓損傷后3 d 可見大量炎癥細胞聚集、血管新生明顯，在一定程度上表明早期炎癥反應(yīng)是牙髓損傷修復(fù)中關(guān)鍵的部分；牙髓損傷后7 d 開髓點下方牙髓組織炎癥減輕，前期牙本質(zhì)明顯增厚，可見骨樣鈣化團塊出現(xiàn)，說明牙髓已出現(xiàn)修復(fù)性反應(yīng)；直至牙髓損傷后14 d 開髓點下方有明顯修復(fù)性牙本質(zhì)生成，炎癥減輕，說明大鼠牙髓損傷模型成功建立。已有國外學(xué)者［8］發(fā)現(xiàn)：MMP-3 可以通過降解牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 （dentin matrix protein-1，DMP-1）促進牙髓細胞的增殖和分化，CCN2 可以促進修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。本研究中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：正常大鼠牙髓組織中無MMP-3 和CCN2 表達，牙髓損傷后0 h 至7 d 時間段牙髓組織中MMP-3 和CCN2 表達逐漸增強，損傷后14 d MMP-3 和CCN2 表達水平下降。本研究中，隨著牙髓損傷時間的延長，牙髓組織中MMP-3 和CCN2 表達位置也有明顯改變：MMP-3 首先表達在穿髓孔下方牙髓組織的間質(zhì)中，3 d 時在炎癥細胞的胞核中表達，成牙本質(zhì)細胞中表達明顯，7 d時成纖維細胞中可見MMP-3 高表達；CCN2 同樣首先表達在穿髓孔下方牙髓組織的間質(zhì)中，3 d 時在炎性細胞胞漿和血管壁中高表達，7 d 時于成纖維細胞和成牙本質(zhì)細胞胞漿中高表達，14 d 后表達減弱。本研究結(jié)果表明：MMP-3 和CCN2 在牙髓炎癥的初期和中期增強了成牙本質(zhì)細胞和成牙本質(zhì)細胞樣細胞的活躍性；MMP-3 和CCN2 在牙髓損傷后不同時間點不同程度地表達于牙髓不同位置，說明MMP-3 和CCN2 在牙髓損傷后的細胞增殖、組織重建過程中發(fā)揮一定作用。MMP-3 在牙髓感染中具有抑制炎癥的作用［23］，而CCN2 在體外能夠促進成牙本質(zhì)細胞樣細胞的增殖和成牙基因的表達［13］；在牙髓受到損傷后感染的初期，牙髓組織內(nèi)細胞分泌MMP-3 和CCN2 是機體發(fā)揮防御反應(yīng)的一種表現(xiàn)，但MMP-3 和CCN2 是否共同發(fā)揮作用尚不明確。

綜上所述，MMP-3 和CCN2 在大鼠牙髓損傷修復(fù)過程中特異性表達，并且很可能在牙髓細胞牙源性分化過程中及牙本質(zhì)修復(fù)性再生時起重要作用，其具體作用機制有待進一步研究。