李夢(mèng)潔, 謝金芳, 尹 碩, 劉 霞

（1. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院綜合口腔治療科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2. 河南省鄭州市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，河南 鄭州 450000；3. 吉林省長(zhǎng)春市口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130041）

牙髓組織受到外界刺激時(shí)，牙齒硬組織和軟組織釋放較低水平的炎癥性分子，可引起牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體產(chǎn)生類(lèi)似于再生修復(fù)的反應(yīng)，通過(guò)上調(diào)P38 蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 途徑，使牙髓的炎癥反應(yīng)最小化，同時(shí)提供更有利的內(nèi)在環(huán)境，促使牙齒硬組織進(jìn)行自身修復(fù)［1-3］。損傷的應(yīng)答和修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，涉及多種因子介導(dǎo)的一系列細(xì)胞、蛋白和細(xì)胞因子間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，但其具體機(jī)制目前尚不清楚。

基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）作為MMPs 家族的重要成員，參與正常及病理性的組織形成［4-5］。MMP-3 在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的遷移中作為非常重要的調(diào)控因子，在很多方 面 起 著 正 負(fù) 調(diào) 控 的 作 用［6-7］。DANIELS 等［8］研究發(fā)現(xiàn)：創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)傷組織中均可見(jiàn)MMP-3 表達(dá)，直至損傷后28 d，提示MMP-3 不僅參與了細(xì)胞外基質(zhì)降解，也與細(xì)胞外基質(zhì)重塑和組織改建有關(guān)。研究［9］表明：MMP-3 在難愈創(chuàng)傷動(dòng)物模型組織中呈高表達(dá)，有促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的作用。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子2 （connective tissue growth factor 2，CCN2） 是CCN 家族成員之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種類(lèi)型的細(xì)胞可以產(chǎn)生CCN2［10-11］，其在胚胎發(fā)育、骨折愈合、細(xì)胞增殖及分化、血管形成和腫瘤發(fā)生等方面均發(fā)揮重要的作用［12-13］。研究［14-15］顯示：MMP-3 和CCN2 在骨和軟骨的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有相互作用，體外研究也證實(shí)CCN2 在MMP-3 的誘導(dǎo)下可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖、遷移和血管的再生。但MMP-3 和CCN2 在牙髓損傷修復(fù)中的表達(dá)變化及其關(guān)系目前尚不明確。

本研究通過(guò)建立大鼠牙髓損傷模型，采用HE 染色和免疫組織化學(xué)染色法觀(guān)察MMP-3 和CCN2 在大鼠牙髓損傷修復(fù)過(guò)程的表達(dá)情況，以探討其在牙髓損傷修復(fù)過(guò)程中的可能作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器清潔級(jí)雄性8 周齡Wistar 大鼠28 只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉） 2008-0011。10%EDTA 液和4% 多聚甲醛（北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司），速眠新（吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司），乙醚（長(zhǎng)春市永輝化工商貿(mào)有限公司），兔抗大鼠MMP-3 多克隆抗體、兔抗大鼠CCN2 多克隆抗體、SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司），其他常規(guī)試劑均購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑公司。1/4 鎢鋼球鉆（日本Mani 公司），高速渦輪機(jī)（上海醫(yī)用儀器設(shè)備廠(chǎng)），CX21 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），自制開(kāi)口器。

1.2 牙髓損傷動(dòng)物模型建立和標(biāo)本制備大鼠健康狀況良好，混合飼料喂養(yǎng)，自由飲水。將大鼠平均分為7 組，每組4 只，隨機(jī)選取一組為對(duì)照組，其余6 組分別為損傷后0 h 組、6 h 組、1 d 組、3 d 組、7 d 組和14 d 組。除對(duì)照組外，其余各組大鼠采用單純開(kāi)放法制備上頜磨牙牙髓損傷模型：大鼠經(jīng)乙醚麻醉，肌注速眠新（0.2 mL·kg－1） 后取仰臥位，將四肢及上頜固定于手術(shù)板上。2%碘伏消毒口腔，用1/4 球鉆在大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙面開(kāi)髓，透粉時(shí)停止操作，探針穿髓，生理鹽水沖洗，無(wú)菌棉球壓迫止血并干燥窩洞，此時(shí)造模成功［1］。所有窩洞制備由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床醫(yī)生單獨(dú)完成。術(shù)后大鼠正常環(huán)境飼養(yǎng)，分別在上述不同時(shí)間點(diǎn)將大鼠乙醚深度麻醉后固定四肢，打開(kāi)胸腔暴露心臟，將針頭刺入左心室，剪開(kāi)右心耳，以引出血液和灌流液。先用輸液器緩慢注入生理鹽水，直至流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛約30 min。待組織變硬立即斷頭，取上頜骨置于4%多聚甲醛溶液中48 h，經(jīng)10%EDTA 脫鈣10 周后，近遠(yuǎn)中向修塊，脫水，透明，浸蠟，包埋，制備厚度為4 μm 連續(xù)切片。

1.3 HE 染色觀(guān)察大鼠牙髓組織病理形態(tài)表現(xiàn)選取通過(guò)穿髓點(diǎn)的切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色10 min，流水沖洗；1%鹽酸乙醇分化1～3 s，流水沖洗；氨水返藍(lán)5～10 s、0.5%伊紅溶液染色5 min，流水沖洗5 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀(guān)察各組大鼠牙髓組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 的定位及蛋白表達(dá)水平選取通過(guò)穿髓點(diǎn)的切片在60℃干燥箱內(nèi)干燥3 d，使組織與玻片更密貼。切片在常溫下脫蠟至水，PBS 緩沖液沖洗3 min×3 遍，置于保濕盒中。室溫下滴加復(fù)合消化酶10 min，PBS 緩沖液沖洗3 min×3 遍；滴加3% H2O2去 離 子 水10 min，PBS 緩 沖 液 沖洗3 min×3 遍；滴加0.1%Tritonx-100 液10 min，PBS 緩沖液沖洗3 min×3 遍；滴加5%BSA 封閉液20 min 后甩掉；分別滴加兔抗鼠的多克隆抗體（武漢博士德），4℃冰箱過(guò)夜；滴加羊抗兔的二抗（北京中杉）20 min，PBS 緩沖液沖洗5 min×3 遍；滴加SABC 試 劑 常 溫20 min，PBS 緩 沖 液 沖 洗5 min×3 遍；滴加新鮮配置的DAB 顯色液鏡下顯色，水洗后蘇木素輕度復(fù)染，樹(shù)膠封片，鏡下觀(guān)察。陰性對(duì)照以PBS 緩沖液代替一抗。在高倍鏡下從每張切片的染色陽(yáng)性區(qū)各隨機(jī)選取3 個(gè)不重疊區(qū)域，用Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)其陽(yáng)性區(qū)的平均吸光度（A） 值，并取均值代表MMP-3 和CCN2 蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用多因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠牙髓組織病理形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組大鼠牙髓組織中可見(jiàn)成牙本質(zhì)細(xì)胞層、乏細(xì)胞層、多細(xì)胞層和固有牙髓分界清楚；外層成牙本質(zhì)細(xì)胞呈柵欄狀排列緊密、整齊，內(nèi)側(cè)成纖維細(xì)胞排列均勻，呈星形，胞漿突起相互連接，間質(zhì)可見(jiàn)血管、纖維。損傷后0 h 組，大鼠牙髓組織中可見(jiàn)血管輕度擴(kuò)張，其他無(wú)明顯變化。損傷后6 h 組，大鼠穿髓孔下方牙髓組織中可見(jiàn)成牙本質(zhì)細(xì)胞核固縮，胞體呈扁平狀排列，血管擴(kuò)張明顯，可見(jiàn)散在炎癥細(xì)胞。損傷后1 d 組，大鼠牙髓組織中可見(jiàn)血管擴(kuò)張及新生血管，穿髓孔下方牙髓乏細(xì)胞層消失，牙髓細(xì)胞生長(zhǎng)活躍。損傷后3 d 組，大鼠穿髓孔下方牙髓組織中可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞聚集，血管新生明顯；炎癥下方成纖維細(xì)胞增殖明顯，呈星形；成牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂。損傷后7 d 組，大鼠穿髓孔下方牙髓組織炎癥減輕，前期牙本質(zhì)明顯增厚，可見(jiàn)骨樣鈣化團(tuán)塊出現(xiàn)，成牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，牙髓組織中可見(jiàn)大量增殖的星形細(xì)胞。損傷后14 d 組，大鼠開(kāi)髓點(diǎn)下方有修復(fù)性牙本質(zhì)生成，較牙本質(zhì)密度低；牙髓組織中增殖細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 的定位對(duì)照組大鼠牙髓組織中幾乎檢測(cè)不到MMP-3的表達(dá)。損傷后0 h 和6 h 組，MMP-3 在大鼠穿髓孔下方牙髓組織間質(zhì)中呈弱陽(yáng)性表達(dá)。損傷后1 d組，MMP-3 在大鼠穿髓孔下方牙髓組織成牙本質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá)。損傷后3 d 組，MMP-3 在大鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞只表達(dá)于胞核中，在增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞胞漿中呈陽(yáng)性表達(dá)。損傷后7 d 組，MMP-3 在大鼠牙髓組織鈣化團(tuán)塊中無(wú)表達(dá)，而在其周?chē)?xì)胞可見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，此外在成牙本質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。損傷14 d 組，MMP-3 在大鼠新形成的修復(fù)性牙本質(zhì)中無(wú)表達(dá)，在牙髓組織中的表達(dá)明顯減弱。見(jiàn)圖2。

對(duì)照組大鼠牙髓組織中幾乎檢測(cè)不到CCN2 的表達(dá)。損傷后0 h 和6 h 組，CCN2 在大鼠穿髓孔下方牙髓組織間質(zhì)中呈弱陽(yáng)性表達(dá)。損傷后1 d 組，CCN2 在大鼠穿髓孔下方牙髓組織成牙本質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá)。損傷后3 d 組，CCN2 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞分布廣泛，集中于大鼠穿髓孔下方牙髓組織淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中。損傷后7 d 組，大鼠牙髓組織中鈣化團(tuán)塊周?chē)梢?jiàn)CCN2 強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，增殖的成纖維細(xì)胞和星型細(xì)胞中也可見(jiàn)CCN2 強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，主要位于胞漿中，此外少量炎癥細(xì)胞中也可見(jiàn)CCN2 陽(yáng)性表達(dá)。損傷后14 d 組，CCN2 在大鼠新形成的修復(fù)性牙本質(zhì)中無(wú)表達(dá)，在修復(fù)性牙本質(zhì)下方成牙本質(zhì)細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)較損傷后7 d 組減弱，胞核中未見(jiàn)CCN2 表達(dá)，細(xì)胞間質(zhì)中可見(jiàn)CCN2 弱陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖1 各組大鼠牙髓組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of pulp tissue of rats in various groups（HE，×200）

2.3 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，損傷后不同時(shí)間組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與損傷后0 h 組比較，損傷后6 h組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），損傷后1、3、7 和14 d 組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖2 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×200）Fig.2 Expressions of MMP-3 protein in pulp tissue of rats in various groups（Immunohistochemistry,×200）

圖3 各組大鼠牙髓組織中CCN2 蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×200）Fig.3 Expressions of CCN2 protein in pulp tissue of rats in various groups（Immunohistochemistry,×200）

3 討 論

目前臨床上針對(duì)根尖孔未形成，因機(jī)械性、外傷或齲源性因素點(diǎn)狀露髓的年輕恒牙，以及根尖已完全形成的意外穿髓、穿髓孔直徑不超過(guò)0.5～1.0 mm 的恒牙，可以采用直接蓋髓術(shù)來(lái)保存活髓。常用蓋髓劑是氫氧化鈣和礦物三氧化物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA），其具有殺菌、滅活內(nèi)毒素和誘導(dǎo)硬組織形成等作用，但存在蓋髓點(diǎn)下方形成壞死硬化層和不能良好地還原牙髓活力等缺點(diǎn)［16-17］。已有研究［18-20］顯示：牙髓損傷后具有一定抵御刺激、進(jìn)行自身修復(fù)的能力。牙髓干細(xì)胞可從深層牙髓組織向創(chuàng)傷表面遷移和增殖，并分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，進(jìn)而形成修復(fù)性牙本質(zhì)，在此過(guò)程中，血管不斷地向組織供給營(yíng)養(yǎng)及氧氣，排出代謝產(chǎn)物及廢物，維持干細(xì)胞和前體細(xì)胞的遷移及供給平衡［21-22］。該修復(fù)潛能是牙髓組織固有的一種生物學(xué)機(jī)能，也是臨床工作中牙髓活髓保存治療的理論基礎(chǔ)。牙髓干細(xì)胞遷移、增殖以及血管形成是牙髓修復(fù)的基礎(chǔ)，但此過(guò)程的分子學(xué)機(jī)制目前尚不清楚。

表1 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達(dá)水平Tab. 1 Expression levels of MMP-3 and CCN2 proteins in pulp tissue of rats in various groups （n=4，）

表1 各組大鼠牙髓組織中MMP-3 和CCN2 蛋白表達(dá)水平Tab. 1 Expression levels of MMP-3 and CCN2 proteins in pulp tissue of rats in various groups （n=4，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with 0 h after injury group.

Group Control After injury 0 h 6 h 1 d 3 d 7 d 14 d MMP-3 0.078 8±0.005 4 CCN2 0.069 6±0.004 7 0.141 2±0.003 9*0.147 1±0.006 5*0.190 6±0.001 5*△0.272 1±0.005 1*△0.378 8±0.006 2*△0.236 8±0.010 1*△294.485＜0.01 FP 0.136 2±0.004 8*0.137 2±0.004 7*0.186 7±0.003 5*△0.265 9±0.007 8*△0.339 0±0.008 3*△0.224 7±0.003 8*△89.977＜0.01

MMP-3 和CCN2 是很好的促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的細(xì)胞因子，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、黏附和分化，對(duì)創(chuàng)面的愈合、血管和神經(jīng)的再生也有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。本研究采用單純開(kāi)放法制備大鼠牙髓損傷模型，HE 染色顯示：牙髓損傷后1 d 可見(jiàn)血管擴(kuò)張、新生血管；牙髓損傷后3 d 可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞聚集、血管新生明顯，在一定程度上表明早期炎癥反應(yīng)是牙髓損傷修復(fù)中關(guān)鍵的部分；牙髓損傷后7 d 開(kāi)髓點(diǎn)下方牙髓組織炎癥減輕，前期牙本質(zhì)明顯增厚，可見(jiàn)骨樣鈣化團(tuán)塊出現(xiàn)，說(shuō)明牙髓已出現(xiàn)修復(fù)性反應(yīng)；直至牙髓損傷后14 d 開(kāi)髓點(diǎn)下方有明顯修復(fù)性牙本質(zhì)生成，炎癥減輕，說(shuō)明大鼠牙髓損傷模型成功建立。已有國(guó)外學(xué)者［8］發(fā)現(xiàn)：MMP-3 可以通過(guò)降解牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 （dentin matrix protein-1，DMP-1）促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖和分化，CCN2 可以促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。本研究中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：正常大鼠牙髓組織中無(wú)MMP-3 和CCN2 表達(dá)，牙髓損傷后0 h 至7 d 時(shí)間段牙髓組織中MMP-3 和CCN2 表達(dá)逐漸增強(qiáng)，損傷后14 d MMP-3 和CCN2 表達(dá)水平下降。本研究中，隨著牙髓損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，牙髓組織中MMP-3 和CCN2 表達(dá)位置也有明顯改變：MMP-3 首先表達(dá)在穿髓孔下方牙髓組織的間質(zhì)中，3 d 時(shí)在炎癥細(xì)胞的胞核中表達(dá)，成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)明顯，7 d時(shí)成纖維細(xì)胞中可見(jiàn)MMP-3 高表達(dá)；CCN2 同樣首先表達(dá)在穿髓孔下方牙髓組織的間質(zhì)中，3 d 時(shí)在炎性細(xì)胞胞漿和血管壁中高表達(dá)，7 d 時(shí)于成纖維細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞胞漿中高表達(dá)，14 d 后表達(dá)減弱。本研究結(jié)果表明：MMP-3 和CCN2 在牙髓炎癥的初期和中期增強(qiáng)了成牙本質(zhì)細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的活躍性；MMP-3 和CCN2 在牙髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)不同程度地表達(dá)于牙髓不同位置，說(shuō)明MMP-3 和CCN2 在牙髓損傷后的細(xì)胞增殖、組織重建過(guò)程中發(fā)揮一定作用。MMP-3 在牙髓感染中具有抑制炎癥的作用［23］，而CCN2 在體外能夠促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖和成牙基因的表達(dá)［13］；在牙髓受到損傷后感染的初期，牙髓組織內(nèi)細(xì)胞分泌MMP-3 和CCN2 是機(jī)體發(fā)揮防御反應(yīng)的一種表現(xiàn)，但MMP-3 和CCN2 是否共同發(fā)揮作用尚不明確。

綜上所述，MMP-3 和CCN2 在大鼠牙髓損傷修復(fù)過(guò)程中特異性表達(dá)，并且很可能在牙髓細(xì)胞牙源性分化過(guò)程中及牙本質(zhì)修復(fù)性再生時(shí)起重要作用，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。