王 澤, 宋 揚(yáng), 秦林偉

(沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽 110034)

干細(xì)胞(stem cell,SC)是指在一定條件下具有無限自我更新增殖和限制性分化能力的一類細(xì)胞,它們能產(chǎn)生表現(xiàn)型和基因型與自己完全相同的子細(xì)胞,也能分化為某種特化細(xì)胞或祖細(xì)胞。按照來源可以分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)和成體干細(xì)胞(adult stem cell),按照分化潛能可分為全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)、多能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)和單能干細(xì)胞(monopotent stem cell)。ESC是典型的全能干細(xì)胞,有形成完整個(gè)體的分化潛能;間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,IPSC)為多能干細(xì)胞,具有產(chǎn)生多種類型細(xì)胞的能力,但是無法發(fā)育成完整的個(gè)體。3種干細(xì)胞在細(xì)胞移植、再生醫(yī)學(xué)、組織工程、毒性評(píng)價(jià)、神經(jīng)退行性疾病治療等領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值日益凸顯,并有望在疾病治療中替代傳統(tǒng)的藥物治療,已經(jīng)成為干細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1 胚胎干細(xì)胞的研究與應(yīng)用

1.1 胚胎干細(xì)胞的建系

胚胎干細(xì)胞是源于早期胚胎或原始性腺的一類全能性干細(xì)胞,具有典型的特征性表面標(biāo)志物如糖脂類SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4及蛋白多糖類TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM2等,是ES建系鑒定、質(zhì)量評(píng)價(jià)及污染判定的標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的ESC培養(yǎng)多采用以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞等為主的有飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系,目前,ES的無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系[1]、無動(dòng)物源性培養(yǎng)體系[2]、懸浮培養(yǎng)體系[3]等培養(yǎng)模式得到了廣泛的探討。ESC建系多來自動(dòng)物的桑椹胚、囊胚等胚胎組織,常用的分離方法有免疫外科法、機(jī)械分離法、酶消化法和單卵裂球法等。1981年首次成功分離獲得小鼠ES細(xì)胞,1988年Thomson等在建立靈長類動(dòng)物恒河猴ES細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,成功建立人的ES細(xì)胞系。目前,已分離獲得了倉鼠、大鼠、兔、豬、牛、綿羊、山羊、水貂、恒河猴、美洲長尾猴等ES細(xì)胞。此外,Kim[4]通過激活小鼠卵母細(xì)胞的方法,分離得到了與受體免疫系統(tǒng)組織相容的胚胎干細(xì)胞系。劉佳等[5]利用孤雌激活的小鼠囊胚建立了2種形態(tài)和生物學(xué)特征極其接近ES的細(xì)胞系Pa-AFSCs和Ja-ASCs,極大地推進(jìn)了胚胎干細(xì)胞的醫(yī)療應(yīng)用進(jìn)程。

1.2 胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

理論上,ESC可以被誘導(dǎo)分化為3個(gè)胚層的所有細(xì)胞類型。目前,人ESCs(hESCs)可以人工誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。由于ESCs在能量代謝、物質(zhì)代謝和大分子合成方面具有獨(dú)特的生理特征,ESCs的生長、自我更新和分化譜系等受到其培養(yǎng)環(huán)境、細(xì)胞因子、營養(yǎng)物質(zhì)等因素的影響顯著,如高水平的蛋氨酸代謝對(duì)于小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)維持自我更新和多能性至關(guān)重要,蛋氨酸代謝水平降低可以促進(jìn)mESCs向3個(gè)胚層分化[6];體外培養(yǎng)基中加入BMP4, Activin A, BGFG和VEGF可以定向誘導(dǎo)mESCs向造血細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[7];單獨(dú)增加Activin A能夠顯著促進(jìn)hESCs向神經(jīng)外胚層細(xì)胞的分化。Park等[8]發(fā)現(xiàn)MAGEA2下調(diào)會(huì)引起mESCs發(fā)生多能性標(biāo)志基因表達(dá)的降低、S期細(xì)胞周期阻滯、caspase依賴的凋亡等生物學(xué)事件。利用shRNA抑制mESCs多梳家族蛋白PHC1的活性,可以上調(diào)mESCs定向分化為心肌細(xì)胞的分化效率[9]。mESC-PA6共培養(yǎng)的條件培養(yǎng)液可以顯著增強(qiáng)mESCs的神經(jīng)分化[10]。ESCs的定向誘導(dǎo)研究對(duì)于了解ESC的多能性、自我更新和系統(tǒng)分化等生物學(xué)過程和分子機(jī)制具有重要的科學(xué)價(jià)值。

1.3 胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用

胚胎干細(xì)胞現(xiàn)已成為研究早期胚胎發(fā)育途徑、疾病預(yù)防和藥物毒性的有力工具。臨床級(jí)別的hESC細(xì)胞系Q-CTS-hESC-2在非xeno條件下可分化成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,在濕性黃斑的損傷區(qū)域可檢測(cè)到rpe樣細(xì)胞層的存在[11]。hESCs經(jīng)過定向誘導(dǎo)可分化為更接近髁突軟骨的細(xì)胞[12],為實(shí)現(xiàn)髁突軟骨的原位修復(fù)提供了一種更合適的和更有前景的工具細(xì)胞。使用CRISPR/Cas9n技術(shù)刪除臨床級(jí)hESC細(xì)胞系中內(nèi)源性SNCA基因,可以降低病患者腦內(nèi)路易體的發(fā)生率[13],為治療帕金森氏病(PD)提供了一種新的細(xì)胞替代治療策略。事實(shí)上,相對(duì)于其他干細(xì)胞,由于胚胎干細(xì)胞的分離和純化較為繁瑣、定向分化的機(jī)制尚不明朗等風(fēng)險(xiǎn)因素較難在臨床中大規(guī)模應(yīng)用,但是單倍體胚胎干細(xì)胞已經(jīng)在基因組印記、遺傳篩選、基因突變細(xì)胞文庫構(gòu)建等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究與應(yīng)用

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的建系

間充質(zhì)干細(xì)胞,又稱多潛能基質(zhì)細(xì)胞,是源于中胚層和外胚層的多能干細(xì)胞,可以從結(jié)締組織或器官間質(zhì)分離獲得,研究顯示,使用基質(zhì)膠消化法得到的ADMSCs成脂、成骨分化潛力優(yōu)于直接消化法。DMEM/F12培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基等是MSCs體外培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基,培養(yǎng)體系中最適宜的鋅離子濃度為10-7mol/L,過高過低均損害骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力。程明等[14]利用質(zhì)粒和脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染,得到穩(wěn)定表達(dá)TERT基因的嶗山奶山羊BMSCs。目前,研究人員相繼建立了兔子、豬、鼠、牛、人等物種的間充質(zhì)干細(xì)胞系,為相關(guān)物種的繁育、種質(zhì)基因庫研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

相對(duì)于其他成體干細(xì)胞,MSCs具有強(qiáng)大的增殖能力和多分化潛能,目前,MSCs可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞,同時(shí),國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(ISCT)確定體外可誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的能力為MSCs鑒定的必檢指標(biāo)。MSCs的分化能力和分化方向受到信號(hào)通路、培養(yǎng)體系、關(guān)聯(lián)基因等因素的調(diào)節(jié)。徐弘遠(yuǎn)等[15]提出微環(huán)境可通過改變細(xì)胞骨架形狀、架構(gòu)等因素影響間充質(zhì)干細(xì)胞分化趨向。賀繼剛等[16]研究發(fā)現(xiàn):miRNA-673-5p通過抑制TSC-1蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化,BMSCs的成骨分化受到多基因的調(diào)節(jié),如RAI3基因敲除可促進(jìn)BMSCs的體外和體內(nèi)成骨[17],過量表達(dá)Lgr5的BMSC表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨能力,抑制Lgr5表達(dá)會(huì)降低BM-MSC的成骨分化能力[18]。這為BMSC在骨再生中的應(yīng)用開辟了廣泛的研究模型。

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用

MSCs因其突出的抗氧化活性、免疫重構(gòu)等特性,是臨床研究和應(yīng)用最為深入的干細(xì)胞。其中,美國批準(zhǔn)了60余項(xiàng)間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床試驗(yàn),已成為阿爾茨海默病、漸凍癥等疾病的新興治療方案。腦室內(nèi)注射的BMSCs可以通過改善星形細(xì)胞炎癥和誘導(dǎo)突觸發(fā)生,修復(fù)AD模型小鼠的認(rèn)知障礙[19],BMSCs移植可以通過抑制T細(xì)胞的增殖和活化,減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,阻止實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)展;通過增強(qiáng)胞葬作用,促進(jìn)心肌I/R大鼠心肌炎癥的消退[20]。劉廣洋等[21]研究發(fā)現(xiàn)MSCs可以通過抑制肺部浸潤的免疫細(xì)胞減輕急慢性肺損傷。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)因其來源方便的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于急性心肌梗死治療、急性肝臟衰竭、腦損傷記憶障礙、造血調(diào)控等方面的探討研究。AMSCs鞘內(nèi)移植可以改善脊髓栓系綜合征大鼠后肢運(yùn)動(dòng)能力,有效促進(jìn)其損傷神經(jīng)的修復(fù)[22],AMSCs大鼠左側(cè)海馬CA3區(qū)移植可以增強(qiáng)癲癇大鼠血清及海馬組織中的自由基清除能力,有效改善機(jī)體的氧化應(yīng)激效應(yīng)。外泌體是間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌的重要組成部分,源于hMSCs的外泌體能夠抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞系的增殖和遷移,促進(jìn)其凋亡,為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供新的治療策略[23]。富含miR-17-92簇的mMSCs外泌體可以被大鼠周圍神經(jīng)末梢攝取,并逆行運(yùn)輸?shù)角敖堑腄RG神經(jīng)元和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,大大增加了中風(fēng)大鼠神經(jīng)可塑性、神經(jīng)發(fā)生和功能恢復(fù)[24]。小鼠腦損注射hADSC-ex后,優(yōu)先被小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞攝取,并通過NF-κB和p38-MAPK信號(hào)通路減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而改善大鼠創(chuàng)傷性腦損傷微環(huán)境,促進(jìn)感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的再生和功能的恢復(fù)[25]。外泌體為間充質(zhì)干細(xì)胞在組織損傷修復(fù)、抗炎治療、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、藥物運(yùn)載體研發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的視角。

3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究與應(yīng)用

3.1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建系

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細(xì)胞重新編程逆轉(zhuǎn)為多能性干細(xì)胞。2006年日本京都大學(xué)Shinya Yamanaka利用病毒載體將轉(zhuǎn)錄因子Oct4, c-Myc, Kif4, Sox2導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞,獲得首例iPSCs,目前,約有10個(gè)基因可以參與體細(xì)胞向iPSCs的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。iPSC性狀與ESC相似,具有相同的二倍體核型、高度的自我更新能力。但是,iPSC建系完成后往往需要從細(xì)胞和組織功能水平等方面進(jìn)行鑒定排查,如胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物是否表達(dá)、啟動(dòng)子去甲基化程度、是否致畸胎瘤等。目前,國內(nèi)外構(gòu)建的人iPSC系多來源于羊水細(xì)胞、尿細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。其中,尿源性細(xì)胞因?yàn)楦菀撰@取、成本低廉、無創(chuàng)傷,重編程效率高,同時(shí)不受性別、年齡和身體狀況等實(shí)驗(yàn)因素干擾的優(yōu)勢(shì)而廣受關(guān)注。

3.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化

目前,iPSC細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為生殖細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、胰島分泌細(xì)胞等終末分化細(xì)胞,甚至間充質(zhì)多能性干細(xì)胞。Kitajima等[26]將黑猩猩成年皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs,并重建了早期神經(jīng)發(fā)育過程,為更好地理解黑猩猩及人腦神經(jīng)發(fā)育的分子細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)提供了有力的工具[27]。UQCRC1 p.Y314S突變的外周血單個(gè)核細(xì)胞可以誘導(dǎo)建立iPSCs系,并在體內(nèi)向3個(gè)胚層分化[27];利用癲癇患者外周單核細(xì)胞,誘導(dǎo)產(chǎn)生了攜帶PIK3R2雜合突變的人iPSC細(xì)胞系,不僅能夠分化為3個(gè)胚層,并表達(dá)內(nèi)源性多能性標(biāo)記物,使得更好地理解癲癇及其早期用藥篩選成為可能[28]。營養(yǎng)物質(zhì)不僅影響體細(xì)胞向iPSC細(xì)胞系的重編程過程,同時(shí)可以決定iPSC特定細(xì)胞系的分化形成[29]。Hepburn等[30]借助誘導(dǎo)性泌尿生殖竇間充質(zhì)共培養(yǎng)技術(shù),大大提高了iPSC體內(nèi)外分化為前列腺組織的成功率。高通量測(cè)序結(jié)果顯示,通過調(diào)節(jié)與TGF-β信號(hào)通路microRNAs 的表達(dá)可以促進(jìn)hiPSCs向NSCs的誘導(dǎo)分化[31]。

3.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的應(yīng)用

事實(shí)上,iPSC細(xì)胞系因其無倫理障礙、來源容易、免疫排斥小、強(qiáng)分化能力等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),開啟了細(xì)胞治療、發(fā)育分化研究、疾病模型建立及藥物評(píng)價(jià)的新紀(jì)元。自體皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPSCs移植可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,如有效緩解大鼠的急性肺損傷和減少炎癥因子釋放,改善小鼠腎組織損傷并對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有一定的治療作用。iPSCs技術(shù)的成熟極大地推動(dòng)了神經(jīng)組織損傷修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)程,研究人員首次成功地將人血細(xì)胞直接重新編程成為神經(jīng)板邊界干細(xì)胞,這些iPSCs可以產(chǎn)生神經(jīng)嵴和中樞神經(jīng)系統(tǒng)譜系的功能細(xì)胞類型,并可以通過基因編輯技術(shù)建模人類疼痛綜合征[32]。吳軒[33]完成了iPSCs定向分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及3D神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,為神經(jīng)疾病模型構(gòu)建和治療研究提供了優(yōu)秀的細(xì)胞模型。此外,小鼠右側(cè)腦室內(nèi)注射的iPSCs通過歸巢效應(yīng),可顯著減少缺氧缺血性腦病新生小鼠神經(jīng)元的丟失和修復(fù)腦損傷。研究顯示,hiPSCs可以被定向誘導(dǎo)為人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器,穩(wěn)定或者恢復(fù)動(dòng)物模型視力。此外,利用帶有疾病基因的體細(xì)胞重編程的iPSCs,為發(fā)病機(jī)制、藥物開發(fā)以及治療方案的研究提供了更加真實(shí)的開發(fā)平臺(tái),利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)建立的Peptide transporter-ko iPSCs被用于腸道藥物吸收效力的研究[34],多重耐藥基因1-ko iPSCs為MDR1潛在底物評(píng)估與藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試提供了良好的研究模型[35],但是,真正應(yīng)用于人類治療的iPSCs細(xì)胞來源方案和移植程序等仍然需要優(yōu)化和驗(yàn)證。

MSCs,iPSCs和EMCs在組織損傷修復(fù)、疾病模型建立、藥物評(píng)價(jià)等應(yīng)用領(lǐng)域均具有各自明顯的優(yōu)勢(shì),同時(shí)也面臨著諸多挑戰(zhàn)和應(yīng)用短板。在安全性方面,ESCs和MSCs的致瘤系數(shù)遠(yuǎn)大于iPSCs,ESCs的倫理道德受限、維持未分化狀態(tài)時(shí)間短、遺傳不穩(wěn)定、誘導(dǎo)分化效率低等狀況大大限制了其在臨床上的深入應(yīng)用。iPSCs技術(shù)的重要性在于其打破了干細(xì)胞研究中不可回避的倫理道德和免疫排斥等局限,為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用和研究提供了一個(gè)全新的視角,但值得注意的是,截至目前,不同組織、器官來源或不同發(fā)育階段的體細(xì)胞生成iPSCs的效率和安全性仍存在較大差別。因此,干細(xì)胞研究領(lǐng)域未來在某些領(lǐng)域仍需要突破性成果來促進(jìn)其應(yīng)用價(jià)值的發(fā)揮,例如: 1)闡明其增殖、分化的內(nèi)部機(jī)制,以促進(jìn)神經(jīng)科學(xué)、心臟病學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中的疾病模型的建立與應(yīng)用;2)基因組編輯工具在干細(xì)胞領(lǐng)域的成熟運(yùn)用,以提高干細(xì)胞應(yīng)用的安全性和穩(wěn)定性;3)廣泛利用組織工程學(xué)、3D支架技術(shù)對(duì)培養(yǎng)體系進(jìn)行改造,提高干細(xì)胞應(yīng)用的可重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)化等。