王坤 朱曼輝 陳莉莉 涂園園 萬光明 梁申芝

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的常見并發(fā)癥，也是工作年齡人群致盲的主要原因[1]。雖然DR的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但研究表明糖尿病患者視網(wǎng)膜的多種異常均與炎癥密切相關(guān)，應(yīng)激性視網(wǎng)膜細(xì)胞產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子失調(diào)是導(dǎo)致神經(jīng)血管損傷的關(guān)鍵因素[2-3]，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等。其中，Müller細(xì)胞源性VEGF是導(dǎo)致DR視網(wǎng)膜炎癥、血管滲漏和病理性血管形成的關(guān)鍵因素[4]。盡管抗VEGF治療具有顯著的療效，但依然存在許多局限性，如需要眼內(nèi)反復(fù)注射，只對疾病晚期有效，更重要的是僅有約一半的患者對治療有應(yīng)答[5]。因此，深入探索DR發(fā)生發(fā)展的機(jī)制對于其預(yù)防及治療具有重要的意義。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt,缺乏蛋白質(zhì)編碼潛能的非編碼RNA。隨著對LncRNA研究的深入，其在DR中的作用已受到廣泛關(guān)注[6]。有研究顯示,母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)在DR患者血漿及小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)降低，沉默MEG3促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成[7-8]，MEG3過表達(dá)抑制大鼠視網(wǎng)膜中IL-1β的產(chǎn)生[9]。但是，有關(guān)MEG3在DR的Müller細(xì)胞中的作用及機(jī)制的報(bào)道尚少，本研究旨在通過構(gòu)建的DR小鼠體內(nèi)模型及高糖刺激視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞株(MIO-M1)的體外模型，探討MEG3在DR的Müller細(xì)胞活化及炎癥因子分泌中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料8周齡健康雄性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量20～22 g，購自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；視網(wǎng)膜Müller干細(xì)胞MIO-M1(北納生物，中國)；DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco，美國)；GFAP、VEGF、IL-1β、ELISA試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Abcam，美國)；GAPDH單克隆抗體(Proteintech，美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國)；MEG3過表達(dá)質(zhì)粒、miR-34a mimic及其陰性對照(RiboBio，廣州)；Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國)；電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(Bio-Rad，美國)；萊卡激光共聚焦顯微鏡(SP8，德國)；冰凍切片機(jī)(SLEE，德國)；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，美國)；酶標(biāo)儀(Gene limited，中國香港)。

1.2 方法

1.2.1 DR小鼠模型制作C57BL/6小鼠共30只飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，使用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為兩組，分別為正常對照組和DR組，每組各15只。正常對照組小鼠未做處理，DR組小鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)8周，再以60 mg·kg-1STZ(美國Sigma公司)連續(xù)腹腔注射5 d構(gòu)建糖尿病模型。當(dāng)血糖>16.7 mmol·L-1且出現(xiàn)多食、多飲、多尿癥狀時(shí)為造模成功。8周時(shí)取各組小鼠雙眼眼球及視網(wǎng)膜進(jìn)行檢測。首先通過50 g·L-1戊巴比妥鈉(0.01 L·kg-1)腹腔注射麻醉小鼠，其中5只小鼠眼球置于固定液中用于免疫熒光化學(xué)檢測。剩余10只小鼠眼球置于培養(yǎng)基中，于手術(shù)顯微鏡下沿眼球角鞏膜緣剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體及外層鞏膜-脈絡(luò)膜復(fù)合體，取得視網(wǎng)膜，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller干細(xì)胞MIO-M1培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的完全培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中。2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與處理分別使用5 mmol·L-1(對照組)及30 mmol·L-1(高糖組)葡萄糖刺激MIO-M1細(xì)胞24 h用于構(gòu)建DR體外模型。取對數(shù)生長期的MIO-M1細(xì)胞接種于6孔板，每孔約2×105個細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)60%～80%時(shí)，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染MEG3過表達(dá)質(zhì)粒、miR-34a mimic及其陰性對照(NC mimic)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后qRT-PCR檢測其轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后加入含30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，根據(jù)轉(zhuǎn)染物的不同將實(shí)驗(yàn)分為：pcDNA組、pcDNA-MEG3組、pcDNA+NC mimic組、pcDNA+miR-34a mimic組、pcDNA-MEG3+NC mimic組、pcDNA-MEG3+miR-34a mimic組。取細(xì)胞培養(yǎng)上清置于-80 ℃用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測IL-1β及VEGF蛋白表達(dá)。

1.2.4 免疫熒光化學(xué)染色快速取出小鼠眼球進(jìn)行固定，然后分別在100 g·L-1、200 g·L-1和300 g·L-1的蔗糖溶液中脫水過夜。使用冷凍切片機(jī)將眼球切成10 μm的薄片，用于免疫熒光化學(xué)染色。

對于MIO-M1細(xì)胞，將細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞玻片上，并在室溫下使用40 g·L-1多聚甲醛固定30 min。隨后2 g·L-1Triton X-100室溫通透5 min；體積分?jǐn)?shù)5%BSA室溫封閉30 min；加GFAP一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育30 min；DAPI復(fù)染后激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.5 Western blot檢測各組小鼠視網(wǎng)膜及細(xì)胞中GFAP及VEGF蛋白的表達(dá)使用組織及細(xì)胞裂解液提取小鼠視網(wǎng)膜組織及MIO-M1細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取蛋白質(zhì)80 μg經(jīng)過100 g·L-1丙烯酰胺凝膠電泳后使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入GFAP及VEGF一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，37 ℃孵育1 h。最后化學(xué)發(fā)光法顯色，拍照，檢測GFAP及VEGF蛋白表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.6 ELISA檢測各組小鼠視網(wǎng)膜及細(xì)胞上清中VEGF及IL-1β蛋白的表達(dá)將小鼠處死后分離視網(wǎng)膜，勻漿、離心吸取的上清和MIO-M1培養(yǎng)基上清各100 μL加入各孔中，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。測量各樣本在450 nm波長下的光密度(D)值，獲得上清中VEGF及IL-1β蛋白的表達(dá)量。

1.2.7 qRT-PCR檢測各組小鼠視網(wǎng)膜及細(xì)胞中MEG3 mRNA及miR-34a的表達(dá)為進(jìn)一步驗(yàn)證MEG3是否通過下調(diào)miR-34a 抑制DR Müller細(xì)胞活化及炎癥因子的產(chǎn)生，我們將miR-34a mimic及MEG3過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-MEG3分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)Müller細(xì)胞中，隨后高糖刺激24 h。Trizol法提取小鼠視網(wǎng)膜組織及MIO-M1細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入MEG3及miR-34a特異性引物，PCR反應(yīng)條件設(shè)置為尿嘧啶DNA糖基酶激活50 ℃ 2 min,預(yù)變性95 ℃ 2 min,變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 15 s,延伸72 ℃ 1 min,4 ℃終止反應(yīng)。每個樣本設(shè)置三個復(fù)孔，使用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。GAPDH作為內(nèi)參基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DR小鼠視網(wǎng)膜的改變及MEG3 mRNA的表達(dá)情況免疫熒光化學(xué)染色(圖1)及Western blot檢

圖1 免疫熒光化學(xué)染色檢測各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP表達(dá)情況

測(圖2A-2B)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，DR組小鼠視網(wǎng)膜中GFAP蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。ELISA檢測(圖2C-2D)結(jié)果顯示，DR組小鼠視網(wǎng)膜VEGF及IL-1β蛋白的表達(dá)均增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。qRT-PCR檢測小鼠視網(wǎng)膜中MEG3 mRNA表達(dá)(圖2E)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，DR組小鼠視網(wǎng)膜中MEG3 mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP、VEGF、IL-1β蛋白及MEG3 mRNA的表達(dá)情況 A、B:Western blot 檢測小鼠視網(wǎng)膜中GFAP及VEGF蛋白表達(dá)；與正常對照組比較，**P<0.01。C、D:ELISA檢測小鼠視網(wǎng)膜VEGF 及IL-1β蛋白表達(dá)；與正常對照組比較，***P<0.001。E:qRT-PCR檢測小鼠視網(wǎng)膜MEG3 mRNA水平；與正常對照組比較，**P<0.01。

2.2 MEG3對Müller細(xì)胞活化及炎癥因子產(chǎn)生的影響使用高糖刺激Müller細(xì)胞構(gòu)建DR體外模型檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖組Müller細(xì)胞中GFAP、VEGF、IL-1β蛋白表達(dá)均升高，MEG3 mRNA表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，與體內(nèi)模型檢測結(jié)果一致。而與高糖組和高糖+pcDNA組比較，高糖+pcDNA-MEG3組可顯著增加MEG3 mRNA表達(dá),并抑制高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達(dá)的升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖3-圖4)。

圖3 免疫熒光化學(xué)染色檢測Müller細(xì)胞中GFAP表達(dá)

圖4 MEG3對Müller細(xì)胞活化及炎癥因子產(chǎn)生的影響 A:qRT-PCR檢測MEG3 mRNA水平，與對照組比較,**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.05。B、C:Western blot檢測Müller細(xì)胞中GFAP及VEGF蛋白表達(dá)；與對照組比較，**P<0.01;與高糖組比較，#P<0.05。D、E:ELISA檢測VEGF蛋白及IL-1β蛋白表達(dá)；與對照組比較，***P<0.001；與高糖組比較,##P<0.01。

2.3 MEG3調(diào)控miR-34a對Müller細(xì)胞活化及炎癥因子產(chǎn)生的影響與pcDNA+NC mimic組比較，pcDNA+miR-34a mimic組GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達(dá)均增加，而其在pcDNA-MEG3+NC mimic組中表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與pcDNA-MEG3+NC mimic組比較，pcDNA-MEG3+miR-34a mimic組中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖5)。

圖5 MEG3調(diào)控miR-34a對Müller細(xì)胞活化及炎癥因子產(chǎn)生的影響 A、B:Western blot 檢測Müller細(xì)胞中GFAP及VEGF蛋白表達(dá)；與pcDNA + NC mimic組比較，*P<0.05；與pcDNA-MEG3+NC mimic組比較，#P<0.05。C、D:ELISA檢測VEGF蛋白及IL-1β蛋白表達(dá)；與pcDNA + NC mimic組比較，*P<0.05,**P<0.01；與pcDNA-MEG3+NC mimic組比較，#P<0.05。A組：pcDNA+NC mimic組；B組：pcDNA+miR-34a mimic組；C組：pcDNA-MEG3+NC mimic組；D組：pcDNA-MEG3+miR-34a mimic組。

2.4 MEG3對miR-34a的調(diào)控作用qRT-PCR檢測小鼠視網(wǎng)膜及Müller細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，DR組小鼠視網(wǎng)膜中miR-34a mRNA表達(dá)升高(圖6A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組Müller細(xì)胞比較，高糖組Müller細(xì)胞中miR-34a mRNA表達(dá)亦升高(圖6B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染MEG3過表達(dá)質(zhì)粒后，與pcDNA組比較，pcDNA-MEG3組中miR-34a mRNA表達(dá)降低(圖6C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 MEG3對miR-34a的調(diào)控作用 A:qRT-PCR檢測小鼠視網(wǎng)膜中miR-34a水平；與正常對照組比較,**P<0.01。B:qRT-PCR檢測Müller細(xì)胞中miR-34a水平；與對照組比較，**P<0.01。C:正常條件下轉(zhuǎn)染MEG3過表達(dá)質(zhì)粒后24 h,qRT-PCR檢測Müller細(xì)胞中miR-34a水平；與pcDNA組比較，**P<0.01。

3 討論

DR是糖尿病引起的最嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥之一。DR早期一般無癥狀，但當(dāng)患者開始出現(xiàn)視力障礙時(shí)，視網(wǎng)膜病變已發(fā)展到幾乎不可逆轉(zhuǎn)的程度[10]。DR主要的病理特點(diǎn)是微血管病變，但在微血管發(fā)生改變之前，即出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞病變[11-12]。Müller細(xì)胞為神經(jīng)視網(wǎng)膜中主要的膠質(zhì)細(xì)胞，其功能障礙被認(rèn)為是DR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[13]。

Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中主要的膠質(zhì)細(xì)胞。它是跨越整個視網(wǎng)膜的唯一細(xì)胞，并且與視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元都緊密接觸[14]。在DR早期，Müller細(xì)胞即被激活并分泌多種細(xì)胞因子，參與視網(wǎng)膜細(xì)胞的免疫和炎癥反應(yīng)[13,15]。Müller細(xì)胞被激活最明顯的標(biāo)志之一是GFAP的表達(dá)增加[16]。GFAP是反應(yīng)性膠質(zhì)增生的常見標(biāo)志物，正常條件下Müller細(xì)胞幾乎不表達(dá)GFAP[17]。本研究中，DR小鼠視網(wǎng)膜中GFAP表達(dá)升高，表明Müller細(xì)胞被激活。Bai等[4]通過條件性敲除小鼠Müller細(xì)胞中VEGF，發(fā)現(xiàn)阻斷Müller細(xì)胞源性VEGF可以顯著抑制缺血誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管和血管滲漏，并減少缺血誘導(dǎo)的血-視網(wǎng)膜屏障破壞。提示Müller細(xì)胞源性的VEGF是導(dǎo)致DR視網(wǎng)膜炎癥、血管滲漏和病理性血管形成的關(guān)鍵因素。本研究中，通過免疫熒光化學(xué)染色及Western blot檢測,我們發(fā)現(xiàn)DR小鼠視網(wǎng)膜及高糖刺激的Müller細(xì)胞中，VEGF蛋白表達(dá)均升高，與以往研究結(jié)果一致。此外，炎癥因子IL-1β的分泌亦增多。通過過表達(dá)MEG3抑制了Müller細(xì)胞的激活及VEGF和IL-1β的產(chǎn)生。提示DR早期Müller細(xì)胞處于激活狀態(tài)，抑制Müller細(xì)胞的活化可能成為DR的重要治療策略。

近年來，大量證據(jù)表明MEG3在DR中發(fā)揮重要作用[7-9]。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，DR患者及糖尿病非DR患者血清中MEG3較正常對照組表達(dá)下降，IL-1β及轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)升高。提高視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞中MEG3的表達(dá)水平，減少了高糖刺激引起的IL-1β和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的升高。DR大鼠中，MEG3通過抑制插頭樣轉(zhuǎn)錄因子O1及IL-1β改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變[9]。沉默MEG3加重了糖尿病引起的體內(nèi)微血管功能障礙，并在體外促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成功能[8]。但MEG3在視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中的作用報(bào)道尚少。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖處理的Müller細(xì)胞中MEG3 mRNA表達(dá)下降，過表達(dá)MEG3 mRNA減少M(fèi)üller細(xì)胞的活化及VEGF、IL-1β的釋放，過表達(dá)MEG3 mRNA或許可以作為DR的潛在治療靶點(diǎn)，抑制DR的發(fā)生發(fā)展。

LncRNA能夠識別microRNA (miRNA)的互補(bǔ)序列，并與其靶向結(jié)合。miRNA是一類普遍存在于生物體基因組中的由內(nèi)源基因編碼的單鏈非編碼RNA分子，長度約為22個核苷酸。隨著對miRNA研究的深入，有證據(jù)表明miRNA在DR發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。miR-34a在高糖刺激的RPE細(xì)胞中表達(dá)升高，沉默miR-34a可抑制高糖導(dǎo)致的RPE細(xì)胞活力降低及凋亡增加[19]。本研究中，DR小鼠視網(wǎng)膜及高糖處理的Müller細(xì)胞中miR-34a表達(dá)均升高，過表達(dá)miR-34a促進(jìn)了高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞中GFAP及VEGF、IL-1β蛋白的表達(dá)。Huang等[20]證實(shí)，MEG3充當(dāng)miR-34a的競爭內(nèi)源性RNA，并以Argonaute 2依賴性方式相互抑制。高糖處理的RPE細(xì)胞中，MEG3通過抑制miR-34a，抑制RPE細(xì)胞的炎癥與凋亡[19]。但有關(guān)Müller細(xì)胞中兩者的靶向關(guān)系報(bào)道尚少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MEG3 mRNA在DR小鼠視網(wǎng)膜及高糖刺激的Müller細(xì)胞中表達(dá)均降低，且過表達(dá)MEG3 mRNA后miR-34a表達(dá)降低，提示MEG3對miR-34a具有調(diào)節(jié)作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證MEG3是否通過下調(diào)miR-34a抑制DR中Müller細(xì)胞活化及炎癥因子的產(chǎn)生，我們將miR-34a mimic及MEG3過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-MEG3分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)Müller細(xì)胞中。結(jié)果顯示,pcDNA-MEG3組GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達(dá)均減少。相反，miR-34a mimic組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達(dá)均增多。共轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3及miR-34a mimic 后，GFAP的表達(dá)及炎癥因子的分泌較單獨(dú)過表達(dá)MEG3組增多。提示MEG3 通過下調(diào)miR-34a 抑制DR中Müller細(xì)胞活化及炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，MEG3 mRNA在DR小鼠視網(wǎng)膜及高糖刺激的Müller細(xì)胞中表達(dá)均下降，MEG3過表達(dá)可抑制Müller細(xì)胞的活化及VEGF、IL-1β的釋放，其機(jī)制與調(diào)控miR-34a有關(guān)。本研究對MEG3在視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中的生物學(xué)功能所做的基礎(chǔ)性研究，將為DR發(fā)病機(jī)制的闡明及新治療手段的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。