王燕 袁遠(yuǎn) 呂佳 龐龍 邱波 蘇冬瑩 關(guān)曉瑩 鄉(xiāng)曉嵐 李堅(jiān)昊

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是老年人首要的致盲性眼病[1]。AMD根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理改變的不同分為濕性AMD和干性AMD，其中干性AMD是最常見的臨床類型[2]。干性AMD早期以玻璃膜疣為主，晚期可發(fā)展至地圖樣萎縮而嚴(yán)重?fù)p害患者視力。干性AMD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，既往研究表明，氧化應(yīng)激與炎癥改變可對視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞造成損害，從而導(dǎo)致AMD發(fā)生發(fā)展[3-5]。另外，很多細(xì)胞因子參與RPE細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，如β淀粉樣蛋白(Aβ)、補(bǔ)體因子H(CFH)、C3、C5等[5-7]。由于干性AMD發(fā)病機(jī)制不明，故迄今尚無有效的治療方法[3]。

補(bǔ)腎益氣活血方——中藥制劑為杞黃顆粒(QHG)，是我們醫(yī)院治療AMD 的經(jīng)驗(yàn)方。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，QHG對AMD患者有一定的臨床療效，有助于穩(wěn)定及改善患者的視力和眼底改變[8]，對AMD患者的血清CFH也有一定的上調(diào)作用[9]。但該方對RPE細(xì)胞的保護(hù)作用未知。本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上探討QHG對人RPE細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，以及對Aβ及補(bǔ)體替代通路終末產(chǎn)物攻膜復(fù)合物(MAC)的影響，以探明其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19購自ATCC公司，使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中孵育。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物QHG主要成分為丹參、枸杞、褚實(shí)子、茺蔚子，由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供，藥品批號：1612350。

1.1.3 主要試劑及儀器DMEM(美國Hyelon公司)，DMSO(廣州威佳科技有限公司)，2.5 g·L-1胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)，Muse Oxidative stress Kit、Muse Multicaspase Kit(美國Millipore公司)，Aβ和 MAC ELISA試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)，RNA 提取試劑盒(美國 Invitrogen 公司)，qPCR 試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。高速離心機(jī)(香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)，渦旋振蕩器(武漢賽維爾生物科技有限公司)，純水儀(青島富勒姆科技有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國Milipore公司)，酶標(biāo)檢測儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)，Real-time PCR 儀(瑞士Roche公司LightCycler 96型)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法篩選QHG最佳藥物濃度將ARPE-19細(xì)胞按每孔4×103個接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后分別加入1 g·L-1、2 g·L-1、4 g·L-1、8 g·L-1QHG溶解液，作用24 h 后棄去培養(yǎng)液，每孔加入含有5 g·L-1MTT的無血清培養(yǎng)液20 μL，37 ℃ 培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，置搖床使甲瓚完全溶解后,在490 nm波長下測定吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.2 細(xì)胞分組根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)對H2O2作用ARPE-19細(xì)胞半數(shù)致死量濃度的篩選，選擇200 μmol·L-1作為H2O2造模加藥濃度;根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇1 g·L-1和2 g·L-1的QHG作為可實(shí)驗(yàn)濃度。ARPE-19細(xì)胞隨機(jī)分成 4 組，對照組:常規(guī)培養(yǎng)，不做特殊處理;H2O2損傷組:200 μmol·L-1H2O2作用ARPE-19細(xì)胞24 h；QHG 低劑量組:1 g·L-1QHG作用ARPE-19細(xì)胞 24 h后，再加入200 μmol·L-1H2O2作用24 h；QHG高劑量組：2 g·L-1QHG作用ARPE-19細(xì)胞 24 h后，再加入200 μmol·L-1H2O2作用24 h。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察將ARPE-19細(xì)胞按每孔 4×103個接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞分組處理后，棄去完全培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后加入40 g·L-1多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS充分沖洗固定液,相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率將各組ARPE-19細(xì)胞收集離心后加入1×PBS 100 μL重懸細(xì)胞。將1×Caspase Buffer 50 μL和Multicaspase Reagent 5 μL在1.5 mL離心管中混勻,混和液分別加入各組細(xì)胞懸液10 μL再混勻，然后將含混和液的離心管置于37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育 30 min。剩余的1×Caspase Buffer加入7-AAD原液5 μL配制成7-AAD工作液。從37 ℃培養(yǎng)箱中取出離心管，避光條件下各加入150 μL 7-AAD工作液，室溫避光孵育5 min。流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Real-time PCR檢測Aβ mRNA的相對表達(dá)量參照 TRIzol 法提取各組ARPE-19細(xì)胞總 RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以 cDNA 為模板，用LightCycler 96型Real-time PCR 儀進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，檢測Aβ mRNA的表達(dá)。Aβ上游引物序列為5’-TGTCCAGAATGGGAAGTGGG-3’,下游引物序列為5’-GTTCAGGGTAGACTTCTTGGC-3’;GAPDH上游引物序列為5’-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3’,下游引物序列為5’-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3’。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，最后數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 ELISA檢測Aβ和MAC的蛋白表達(dá)水平4組細(xì)胞分別處理結(jié)束后,將上清液移至EP管中,通過ELISA試劑盒檢測Aβ和MAC的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，空白孔加通用稀釋液,其余相應(yīng)孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本(每孔100 μL)，酶標(biāo)板用封口膠密封后,37 ℃溫育 60 min后棄去液體，充分清洗酶標(biāo)板5次,將水分徹底吸干。在各孔中依次加入顯色液 A 50 μL和顯色液 B 50 μL。37 ℃ 避光顯色15 min后，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測各孔吸光度值。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算Aβ和MAC的蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 QHG對RPE細(xì)胞形態(tài)的影響相差顯微鏡下可見,對照組：ARPE-19細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形，細(xì)胞間連接緊密，融合度良好(圖 1A)；H2O2損傷組：ARPE-19細(xì)胞由梭形變成圓形，細(xì)胞間連接疏松，融合不佳，凋亡細(xì)胞數(shù)增加(圖 1B)；QHG低劑量組：細(xì)胞形態(tài)較H2O2損傷組好轉(zhuǎn)，部分細(xì)胞恢復(fù)梭形(圖1C)；QHG高劑量組：大部分細(xì)胞恢復(fù)梭形，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(圖 1D)。對照組、H2O2損傷組、QHG低劑量組、QHG高劑量組每高倍視野下細(xì)胞數(shù)分別為(150.00±20.00)×104個、(25.00±4.00)×104個、(79.30±3.05)×104個、(92.00±7.21)×104個。H2O2損傷組ARPE-19細(xì)胞數(shù)較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.62，P<0.01)；QHG低劑量組、QHG高劑量組ARPE-19細(xì)胞數(shù)均較H2O2損傷組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.70、14.07，均為P<0.01)，但QHG高劑量組與QHG低劑量組間ARPE-19細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 相差顯微鏡下各組ARPE-19細(xì)胞形態(tài)(×100) A：對照組；B：H2O2損傷組；C：QHG低劑量組；D：QHG高劑量組。

2.2 QHG對RPE細(xì)胞凋亡率的影響對照組、H2O2損傷組、QHG低劑量組、QHG高劑量組ARPE-19細(xì)胞凋亡率分別為(6.85±0.14)%、(43.60±1.80)%、(23.23±1.43)%、(17.90±0.78)%。H2O2損傷組ARPE-19細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加(t=20.34，P<0.001);QHG低劑量組、QHG高劑量組ARPE-19細(xì)胞凋亡率均較H2O2損傷組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.86、13.10，均為P<0.01)，且QHG高劑量組ARPE-19細(xì)胞凋亡率較QHG低劑量組降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.27，P<0.05)(見圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組ARPE-19細(xì)胞凋亡率 A：對照組；B：H2O2損傷組；C：QHG低劑量組；D：QHG高劑量組。

2.3 QHG對Aβ mRNA表達(dá)的影響Real-time PCR 檢測結(jié)果顯示，H2O2損傷組Aβ mRNA相對表達(dá)量較對照組上調(diào)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.38，P<0.01)。QHG低劑量及QHG高劑量組Aβ mRNA表達(dá)水平均較H2O2損傷組降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.52、10.00，均為P<0.01)，但QHG高劑量組與QHG低劑量組Aβ mRNA表達(dá)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖3)。

圖3 Real-time PCR檢測各組ARPE-19細(xì)胞Aβ mRNA相對表達(dá)量 與對照組比較，##P<0.01；與H2O2損傷組比較，**P<0.01。

2.4 QHG對Aβ及MAC的蛋白表達(dá)的影響ELISA檢測結(jié)果顯示,與對照組相比，H2O2損傷組Aβ及MAC的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.88、4.99，均為P<0.01)。與H2O2損傷組比較，QHG低劑量組、QHG 高劑量組均可明顯下調(diào)Aβ及MAC的蛋白表達(dá)水平，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Aβ蛋白：t=7.51、10.00，均為P<0.01；MAC蛋白：t=4.83、6.83，均為P<0.01)，但QHG高劑量組與QHG低劑量組間Aβ及MAC的蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見表1)。

表1 各組ARPE-19細(xì)胞上清液Aβ 及MAC蛋白表達(dá)水平

3 討論

在我國，隨著人口老齡化程度增加和人們壽命延長，AMD成為導(dǎo)致失明的重要原因之一。干性AMD占AMD的80%～90%[10]，是AMD最常見的類型。干性AMD發(fā)病機(jī)制不明，至今尚無有效藥物治療方法，中藥治療AMD在我國應(yīng)用廣泛，但其具體作用機(jī)制尚不明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，QHG具有改善或穩(wěn)定AMD患者視力的作用，并具有上調(diào)人血清CFH的作用[8-9]。本研究即在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討QHG對人RPE細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

大量研究表明,氧化應(yīng)激損傷是 AMD 最為重要的發(fā)病機(jī)制,氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞內(nèi)活性氧堆積，造成細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能障礙及結(jié)構(gòu)失調(diào)[11]。H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑，多用于誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷[11]。本研究采用H2O2誘導(dǎo)的 ARPE-19 細(xì)胞來建立氧化應(yīng)激AMD模型，結(jié)果顯示，APRE-19細(xì)胞在給予200 μmol·L-1H2O2處理后，相差顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞明顯增多，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率達(dá)(43.60±1.80)%，較對照組的(6.85±0.14)%明顯增高；而在給予1 g·L-1及2 g·L-1QHG預(yù)處理后，相差顯微鏡下正常細(xì)胞數(shù)明顯增多，細(xì)胞凋亡率分別降低到(23.23±1.43)%和(17.90±0.78)%。說明QHG能顯著減少H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的凋亡。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Aβ是干性AMD發(fā)病機(jī)制中的重要啟動因子[12]。Aβ可在人RPE細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上表達(dá)[13]。生理情況下Aβ的生成和降解處于動態(tài)平衡中，某些病理情況下這一平衡被破壞，導(dǎo)致Aβ在眼內(nèi)大量聚集，Aβ在眼內(nèi)具有毒性作用，其可直接損傷RPE細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；也可激活細(xì)胞及視網(wǎng)膜內(nèi)的補(bǔ)體替代途徑，誘導(dǎo)眼內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)；還可參與玻璃膜疣的形成[12-14]。本研究結(jié)果顯示，H2O2可明顯升高ARPE-19細(xì)胞的Aβ mRNA和蛋白的表達(dá)，QHG可降低ARPE-19細(xì)胞Aβ mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示QHG通過降低Aβ的表達(dá)而保護(hù)ARPE-19細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的炎癥損傷。

2005年，遺傳基因?qū)W發(fā)現(xiàn)CFH的多態(tài)性與AMD相關(guān)[15]，隨后研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體替代途徑異常激活引起的視網(wǎng)膜局部亞炎癥反應(yīng)是AMD發(fā)生發(fā)展的重要因素[16]。補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物是該通路的終末產(chǎn)物，又稱作MAC，其作用于RPE細(xì)胞的細(xì)胞膜，可使RPE細(xì)胞溶解[17]。正常生理情況下，該通路處于低活化狀態(tài)；在病理狀態(tài)下，該通路會被異常激活而發(fā)生補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)，引起炎癥因子釋放及MAC生成，導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織持續(xù)性亞炎癥反應(yīng)，自身正常的RPE細(xì)胞及脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞受到攻擊，造成組織受損[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可激活補(bǔ)體替代途徑而導(dǎo)致視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)[18]。Kumar等[18]在小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠年齡的增長，Aβ在RPE層的表達(dá)增多，隨之誘導(dǎo)MAC表達(dá)增多而使小鼠視網(wǎng)膜萎縮。本研究發(fā)現(xiàn)，QHG可降低ARPE-19細(xì)胞MAC蛋白表達(dá)水平，提示QHG可通過下調(diào)MAC的表達(dá)而起到抑制炎癥、減少ARPE-19細(xì)胞凋亡的作用。

QHG是一種復(fù)方制劑，由丹參、枸杞、褚實(shí)子、茺蔚子等組成，其中丹參和枸杞是該藥最主要的成分。現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究顯示，QHG中的很多中藥單體都具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用。Mao等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在氧化損傷條件下，丹參通過降低RPE細(xì)胞白細(xì)胞介素-18 和腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的表達(dá)而起到抗炎作用；Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，丹參的活性成分之一丹參酮在急性心肌損傷模型大鼠中具有調(diào)節(jié)補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的作用。曹秀朋等[21]報(bào)道，枸杞子提取物能有效抑制光誘導(dǎo)所致小鼠RPE細(xì)胞的損傷，并能提高血清的抗氧化能力。宋宇等[22]研究發(fā)現(xiàn)，茺蔚子具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。本研究發(fā)現(xiàn)，QHG具有降低Aβ及MAC表達(dá)的作用，對ARPE-19細(xì)胞炎癥損傷有保護(hù)作用，結(jié)合上述中藥單體的藥理學(xué)研究我們推測，QHG對RPE細(xì)胞的抗炎作用與這些中藥單體藥理學(xué)作用相關(guān)。

綜上所述，QHG能有效抑制H2O2損傷所致ARPE-19細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞Aβ及MAC表達(dá)量，從而起到保護(hù)人RPE細(xì)胞的作用。本研究為QHG臨床運(yùn)用提供了理論基礎(chǔ)，但還需要更多的臨床及分子生物學(xué)研究深入地探討其作用機(jī)制。