李培旺， 趙夢瑞， 馬江山， 黎繼烈， 曹慧芳

(1.湖南省林業(yè)科學院， 湖南 長沙 410004; 2.中南林業(yè)科技大學， 湖南 長沙 410004; 3.長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院， 湖南 長沙 410004)

油桐Verniciafordii(Hemsl .)Airy shaw屬大戟科油桐屬樹種，是我國重要的木本油料樹種，具有較廣泛的工業(yè)用途，主要分布于中國湖南、江西、海南、廣西、陜西、江蘇、福建、云南等省區(qū)[1-2]。目前，我國油桐產量居世界第一。油桐的加工利用主要是以提取桐油為主，油桐果殼、油桐餅粕等加工剩余物被丟棄，資源利用率不到20%，造成資源浪費和環(huán)境污染。油桐粕富含多種有效成分，其中含有蛋白質36.3%～45.0%、糖6.94%、淀粉18.58%、五氧化二磷1.8%～2.7%、氧化鉀1.2%～1.3%、有機質75%～80%，以及多種微量元素，是生產有機肥的理想原料[3-4]。目前，國內對于油桐粕的研究主要集中在其有效活性成分及毒性分析等[5-8]。針對目前油桐粕無法得到及時有效、高值化利用的現(xiàn)狀，亟需對其進行深度開發(fā)與利用。

響應面分析是基于統(tǒng)計學和數(shù)學建模對多個因素及其交互作用進行優(yōu)化分析，既可以減少試驗次數(shù)，又可獲得較精確有效的結果，常用于微生物培養(yǎng)和生物發(fā)酵最佳條件的確定[9-10]。張蕾、印楊等[11-12]采用響應面分析方法分別對枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后有效成分明顯提高。本試驗采用響應面分析法對影響油桐粕發(fā)酵生產有機肥的各因素進行系統(tǒng)分析，確定最佳發(fā)酵外部條件和內部原料特性，構建有機肥生產工藝條件，為后續(xù)油桐粕資源開發(fā)利用和解決環(huán)境污染問題提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LYT-1、LYT-5和SZ1菌種由省部共建木本油料資源利用國家重點實驗室提供，為中南林業(yè)科技大學和湖南省林業(yè)科學院分離獲得；油桐粕由湖南國盛生物能源股份有限公司提供，經粉碎機粉碎后過40目篩；石油醚( 30～60 ℃)、濃硫酸、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵條件單因素試驗 影響油桐粕發(fā)酵效果的主要因素包括菌種配比、接種量、油桐粕初始含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間。本試驗各因素設置的水平見表1。

表1 單因素試驗設計表Tab.1 Factors and levels of single factor test因素水平菌種配比(LYT-1∶LYT-5∶SZ1)a(1∶1∶1)、b(2∶1∶1)、c(2∶1∶2)、d(3∶1∶2)、e(3∶1∶3)、f(3∶2∶3)、g(3∶2∶1)、h(4∶2∶3)、i(5∶3∶4)、j(5∶2∶4)、k(7∶3∶4)接種量/%10、15、20、25、30、35、40、45、50油桐粕初始含水量/%30、40、50、60、70發(fā)酵溫度/℃25、30、35、40、45、50發(fā)酵時間/d4、6、8、10、12、14、16、18 注: 菌種配比為體積比。

1.2.2 發(fā)酵條件響應面優(yōu)化 根據單因素試驗結果，選擇對油桐粕發(fā)酵影響較大的接種量(A)、油桐粕初始含水率(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵時間(D)等 4個因素，按照Box-Behnken進行試驗設計，每個因素設3個水平(見表2)。試驗結果采用Design Expert 8.0 軟件進行優(yōu)化分析，獲得油桐粕發(fā)酵最佳條件，并進一步通過試驗進行驗證。

表2 Box-Benhnken試驗因素與水平Tab.2 Levels of the variables tested in Box-Benhnken de-sign編號因素水平-101A接種量/%303540B油桐粕初始含水量/%405060C發(fā)酵溫度/℃354045D發(fā)酵時間/d81012

1.2.3 指標測定 蛋白質測定參照GB /T5009.5—2003；粗脂肪測定參照GB/T14772—2008;含水量測定參照GB /T5009.3—2010;氨基態(tài)氮測定采用甲醛法[13-14]。

2 結果與分析

2.1 油桐粕基本成分

蛋白質大分子可通過微生物降解為作物易吸收的小分子氨基酸，蛋白質含量高低為是否可作為有機肥生產原料的一個重要指標。油桐粕中蛋白質、粗脂肪以及水分含量的測定結果(表3)顯示，其中蛋白質含量高達38.6%，與文獻[15]中蛋白質含量36.3%～45%基本一致?？梢?，油桐粕是生產有機肥的理想原料。

2.2 單因素試驗

2.2.1 菌種配比對發(fā)酵效果的影響 通過LYT-1、LYT-5和SZ1菌種發(fā)酵均可以把油桐粕中的蛋白質降解成植物易于吸收的小分子氨基酸，其配比對油桐粕發(fā)酵的影響見圖1。圖1顯示，當LYT-1、LYT-5、SZ1的配比為5∶3∶4時，發(fā)酵后油桐粕中氨基態(tài)氮的含量最高，達到39.2 mg·g-1。這可能是由于該種配比下3個菌種協(xié)同效應最大，所產生的蛋白酶最多，且酶活性最高，從而有利于油桐粕中蛋白質降解成氨基酸。

表3 油桐粕中蛋白質、粗脂肪及水分的含量Tab.3 Components content of protein, crude fat, and moisture in tung oil cake%成分含量蛋白質38.6粗脂肪7.2含水量6.3

2.2.2 接種量對發(fā)酵效果的影響 接種量對油桐粕發(fā)酵效果的影響見圖2。圖2顯示：隨著接種量的增加，發(fā)酵后油桐粕中氨基態(tài)氮含量升高；接種量在35%時最高，達到38.8 mg·g-1；而后隨著接種量的增加逐漸降低。這可能是由于接種量超過了發(fā)酵所需的最適量，菌株生長受到影響，酶的產量及活性降低，且大量的氨基態(tài)氮被微生物生長繁殖所消耗，使得氨基態(tài)氮含量降低。

2.2.3 油桐粕初始含水量對發(fā)酵效果的影響 發(fā)酵原料合適的水分含量能給微生物提供良好的生長環(huán)境[16]，原料的初始含水量對其發(fā)酵后的氨基態(tài)氮含量的影響是顯著的。由圖3可知：油桐粕的初始含水量在30%～60%時，其發(fā)酵后的氨基態(tài)氮含量隨著初始含水量的增加而增加，當初始含水量為60%時，氨基態(tài)氮含量達到最高值，為40.3 mg·g-1；而后隨著初始含水量的增加，氨基態(tài)氮含量快速下降。這是由于初始含水量太高，發(fā)酵底物的通氣性和散熱性變差，不利于微生物的生長，從而影響酶的產量和酶的活性，最終影響油桐粕中蛋白質的降解。

2.2.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響 溫度是影響微生物生長的重要因素之一[17]，合適的溫度可為微生物生長提供良好的生存環(huán)境。溫度對油桐粕發(fā)酵效果的影響如圖4所示。由圖4可知：發(fā)酵溫度在30～40 ℃時，發(fā)酵后桐粕中氨基態(tài)氮含量隨著發(fā)酵溫度的增加而增加，當發(fā)酵溫度為40 ℃時，氨基態(tài)氮含量達到最高值，為42.7 mg·g-1；而后隨著溫度的上升，氨基態(tài)氮含量快速下降。這是由于溫度超過微生物生長最適溫度范圍時，微生物細胞膜的流動性和內外物質的交換受影響，同時過高的溫度也容易引起蛋白酶失活。

2.2.5 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響 由圖5可知：在發(fā)酵時間為2～10 d時，發(fā)酵后油桐粕中氨基態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時間的增加而快速增長，這是由于在這個階段中發(fā)酵體系可為微生物生長提供足夠的空間和營養(yǎng)物質；當發(fā)酵時間為10 d時，氨基態(tài)氮含量達到最高值，為42.1 mg·g-1；而后隨著培養(yǎng)時間的延長，氨基態(tài)氮含量降低，這是由于此階段發(fā)酵體系中的微生物量已達上限，相互之間出現(xiàn)競爭，氨基態(tài)氮代謝產物被當作營養(yǎng)物質消耗。

2.3 最佳發(fā)酵條件響應面試驗

2.3.1 響應面試驗結果 基于單因素試驗結果，綜合分析了接種量、油桐粕初始含水率、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等4個因素對氨基態(tài)氮含量的影響；利用Box-Behnken試驗設計對油桐粕發(fā)酵條件進行優(yōu)化分析，結果如表4和表5所示。

通過方差分析，得到氨基態(tài)氮含量的二次回歸方程：

表4 Box-Benhnken試驗設計及結果Tab.4 Experimental design and results of Box-Benhnken design序號因素ABCDY(氨基態(tài)氮含量)/(mg·g-1)130.0040.0040.0010.0030.5235.0060.0045.0010.0039.1335.0050.0040.0010.0034.9435.0050.0040.0010.0034.6530.0050.0040.0012.0033.8635.0050.0035.008.0033.7735.0060.0040.008.0041.2835.0040.0040.0012.0031.2940.0050.0045.0010.0032.81040.0040.0040.0010.0031.91140.0050.0040.0012.0034.21230.0050.0045.0010.0031.41335.0050.0040.0010.0035.31435.0050.0035.0012.0034.11535.0050.0040.0010.0035.81635.0050.0040.0010.0035.51735.0040.0035.0010.0030.41840.0050.0040.008.0034.01930.0060.0040.0010.0038.82035.0040.0045.0010.0029.82135.0050.0045.0012.0033.22240.0060.0040.0010.0042.02330.0050.0040.008.0031.92435.0040.0040.008.0030.72535.0060.0040.0012.0042.22640.0050.0035.0010.0033.82735.0050.0045.008.0032.52830.0050.0035.0010.0031.82935.0060.0035.0010.0039.3

Y=35.22+0.87A+4.77B-0.36C+

0.47D+0.45AB-0.15AC-0.42AD+

0.10BC-0.10BD+0.075CD-1.13A2+

1.51B2-1.76C2-0.29D2。

2.3.2 響應面分析及優(yōu)化 根據回歸分析結果作出4個因素對發(fā)酵后油桐粕中氨基態(tài)氮含量的影響及其交互作用圖(圖6)，結合表5進行分析，求得油桐粕發(fā)酵生產有機肥的最佳工藝為：接種量37.76%、初始含水量60%、發(fā)酵時間10.5 d和發(fā)酵溫度40 ℃。理論上在此條件下發(fā)酵桐粕中氨基酸含量為43.91 mg·g-1。

表5 回歸系數(shù)顯著性Tab.5 Significant analysis of regression coefficient變異來源平方和自由度均方F值Pr>F變異來源平方和自由度均方F值Pr>F模型338.761424.2083.46< 0.000 1A9.1919.1931.69< 0.000 1B272.651272.65940.45< 0.000 1C1.5411.545.310.037 0D2.6112.619.010.009 5AB0.8110.812.790.116 8AC0.09010.0900.310.586 2AD0.7210.722.490.136 7BC0.04010.0400.140.715 9BD0.04010.0400.140.715 9CD0.02210.0220.0780.784 6A28.2918.2928.610.000 1B214.72114.7250.79< 0.000 1C220.00120.0068.98< 0.000 1D20.5610.561.930.187 0殘差4.06140.29失擬項3.15100.321.390.402 7凈誤差0.9140.23總離差342.8228R2=98.82%, R2adj =97.63% 注:??表示差異極顯著(P<0.01);?表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 回歸模型的驗證 為了驗證響應面試驗所得結果的可靠性，采用響應面分析得出的最佳提取工藝條件參數(shù)進行驗證試驗，3次平等試驗所得到的油桐粕發(fā)酵后氨基態(tài)氮的含量平均達到44.8 mg·g-1，與理論預測值的差異不顯著，表明所建模型具有較好的預測效果。

3 結論與討論

趙夢瑞等[15]研究發(fā)現(xiàn)LYT-1、 LYT-5和SZ1 3種菌均具有高產氨基酸、解磷、病害拮抗和促生長能力，且合適的配比可提高發(fā)酵后油桐粕中氨基態(tài)氮的含量。發(fā)酵時間、溫度等外部條件是影響微生物發(fā)酵的關鍵因素[18-20]，發(fā)酵溫度主要影響微生物的生長、細胞膜的流通動性、酶的產量及活性等。

油桐粕發(fā)酵生產有機肥是一個動態(tài)的過程，受到微生物種類及用量、外部發(fā)酵條件和原料特性諸多因素的影響。本研究通過單因素試驗與Box-Behnken試驗相結合，對油桐粕發(fā)酵生產有機肥過程中菌種組合、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、油桐粕的初始含水率等各因子及其交互作用進行評價，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量37.76%、初始含水量60%、發(fā)酵時間10.5 d和發(fā)酵溫度40 ℃。驗證試驗證明實測值與理論預測值的差異不顯著，所建模型具有較好的預測效果。因此，本研究結果為油桐粕工廠化發(fā)酵生產有機肥提供了技術支撐。