周中明，嚴(yán)小虎，梁 磊

骨肉瘤是一種最常見的原發(fā)性的惡性骨腫瘤[1]，多發(fā)于20歲以下的青少年或兒童[2]，在小兒骨惡性腫瘤中最多見，約占小兒腫瘤的5%。骨肉瘤具有高侵襲能力、惡性程度高和預(yù)后不良等特點(diǎn)，且男性的發(fā)病率高于女性[3]。由于其發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，預(yù)后差，經(jīng)各種化療和輔助治療，病人5年的存活率可上升至60%～80%[4]。然而骨肉瘤的轉(zhuǎn)移性較早，且容易產(chǎn)生耐藥性，所以其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高[5]。目前，臨床上對骨肉瘤的早期診斷仍很困難，生物學(xué)標(biāo)志物的靈敏性和特異度均不高，導(dǎo)致對骨肉瘤的診斷價(jià)值欠佳，因此急需找到對骨肉瘤早期診斷的標(biāo)志性物質(zhì)。近年來，微小RNA(miRNA)的異常表達(dá)可影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。miRNAs是一種高度保守的非編碼的單鏈RNA，其在機(jī)體內(nèi)通過在RNA轉(zhuǎn)錄水平上結(jié)合特異性的靶基因，從而達(dá)到基因沉默的效果，充當(dāng)“基因海綿”的作用，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[6-7]。相關(guān)報(bào)道證明，miR-432作為一個新發(fā)現(xiàn)的miRNA，在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，在肺癌、胃癌和宮頸癌等腫瘤組織中顯著下調(diào)[8]，但在骨肉瘤中的表達(dá)情況及作用機(jī)制尚未明確。另有研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，miR-646與肝癌的發(fā)生于易感性密切相關(guān)，也被證明在肺癌、肝癌和腎細(xì)胞癌中表達(dá)降低的現(xiàn)象。而miR-100屬于miR-99家族的一員，可隨著人類腫瘤微環(huán)境的改變而發(fā)揮著促癌或抑癌的作用[12-13]。研究表明，miR-100在肝癌、乳腺癌和宮頸癌等腫瘤中低表達(dá)[14]，在骨肉瘤中的作用卻鮮有報(bào)道。因此，本研究通過對骨肉瘤病人中miR-432、miR-646和miR-100的表達(dá)研究，分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，分析它們之間表達(dá)水平的相關(guān)性，為骨肉瘤的診斷、治療及預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年2月至2019年2月首次治療并經(jīng)病理確診為骨肉瘤的72例病人作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病人均經(jīng)病理組織學(xué)確診；(2)所有病人的臨床資料均完整性高，且順從性好；(3)經(jīng)病人及其家屬同意，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有高血壓、長期酗酒等病人；(2)伴有心血管、腎臟病變等病人；(3)伴有其他惡性腫瘤的病人；(4)伴有精神病病人。骨肉瘤病人男39例，女33例；年齡10～40歲；病人腫瘤直徑≥7 cm的37例，<7 cm的35例；臨床TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期29例，Ⅲ期16例。參照夏賢良等的方法計(jì)算腫瘤壞死率(tumor necrosis rate，TCNR)(%)[15]，≥90%的32例，<90%的40例。另外選取骨模型骨肉瘤旁組織38例作為對照組，所有研究過程均符合我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 Trizol試劑由美國Invitrogen公司提供，cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green Master Mix試劑盒均由Vazyme公司提供，酶聯(lián)免疫試劑盒由ebioscience公司提供，miR-432、miR-646和miR-100引物由南京金唯智生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。主要儀器為Thermo公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì)和TCA5020的普通PCR儀，美國ABI公司的7500-實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，日本SANYO公司提供的凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司提供的電泳儀和電泳槽，多功能酶標(biāo)儀由美國Thermo公司提供。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 每對組織為腫物和瘤旁組織(距離病灶≥5 cm)，在手術(shù)切除后10 min之內(nèi)獲得。取材后置于無菌凍存管中，儲存于-80 ℃。應(yīng)用RT-PCR法檢測miR-432、miR-646和miR-100的表達(dá)水平。用Trizol試劑提取組織細(xì)胞中RNA，整個過程嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。提取骨肉瘤病人組織細(xì)胞和骨肉瘤旁組織細(xì)胞的RNA。miR-432、miR-646和miR-100逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACA TGG TT-3′。具體的逆轉(zhuǎn)錄條件為16 ℃(30 min)，42 ℃(30 min)和75 ℃(15 min)，在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，先使用95 ℃變性10 min，溫度維持15 s，而后用60 ℃反應(yīng)1 min，連續(xù)進(jìn)行40個循環(huán)，每個反應(yīng)平均進(jìn)行3次。對反應(yīng)管中熒光信號達(dá)到指定區(qū)域經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值，采用U6為內(nèi)參，使用相對定量法計(jì)算腫瘤組織目的基因表達(dá)水平與配對的正常組織相差的倍數(shù)，即2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(腫瘤CtmiRNA-CtU6)-(正常CtmiRNA-CtU6)。

1.4 觀察指標(biāo) 對比骨肉瘤組織和骨肉瘤旁的組織細(xì)胞miR-432、miR-646和miR-100的表達(dá)差異，同時(shí)分析其與臨床病理參數(shù)之間的聯(lián)系，另外對miR-432、miR-646和miR-100表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗(yàn)、方差分析、q檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-432、miR-646和miR-100在骨肉瘤和骨肉瘤旁組織細(xì)胞中的表達(dá)水平比較 與瘤旁組相比，骨肉瘤組的miR-432、miR-646和miR-100的表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

表1 2種組織細(xì)胞中miR-432、miR-646和miR-100的表達(dá)水平

2.2 骨肉瘤病人組織細(xì)胞中miR-432、miR-646和miR-100的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系 骨肉瘤組織細(xì)胞中miR-432、miR-646和miR-100的表達(dá)水平與病人的性別、年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類型、發(fā)病部位和TCNR均無關(guān)(P>0.05)，而與病人的TNM分期和是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移相關(guān)，miR-432和miR-100表達(dá)量隨著TNM分期增加而降低，miR-646表達(dá)量Ⅲ期低于Ⅰ期和Ⅱ期，發(fā)生肺轉(zhuǎn)移病人miR-432、miR-646和miR-100表達(dá)量均低于非肺轉(zhuǎn)移病人，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見表2～4)。

表2 骨肉瘤病人組織細(xì)胞中miR-432的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系

續(xù)表2

表3 骨肉瘤病人組織細(xì)胞中miR-646的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系

2.3 骨肉瘤病人中miR-432、miR-646和miR-100的表達(dá)量間的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤病人中miR-432的表達(dá)水平與miR-646和miR-100的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.76和0.79，P<0.05)，而腫瘤病人中miR-646的表達(dá)水平與miR-100的表達(dá)水平同樣呈正相關(guān)(r=0.81，P<0.01)(見圖1～3)。

表4 骨肉瘤病人組織細(xì)胞中miR-100的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系

3 討論

骨肉瘤是青少年及兒童極易發(fā)生的一種常見原發(fā)性惡性腫瘤，它生長速度極快，且很容易發(fā)生遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移[16]。多年前，由于醫(yī)學(xué)影像技術(shù)和化療藥物未曾有效普及，臨床上大都采用截肢的手術(shù)進(jìn)行治療；雖然截肢手術(shù)能夠最大程度限制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，但據(jù)以往研究報(bào)道顯示，骨肉瘤病人5年內(nèi)的存活率仍低于20%[17]，且大都死于肺轉(zhuǎn)移。近年來，隨著醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，骨肉瘤的治療和預(yù)后得到了極大的改善。但臨床上，我國對骨肉瘤的化療療效的提高并不顯著，沒有形成一個統(tǒng)一、規(guī)范的化療方案。仍有接近40%的病人的化療預(yù)后不良，骨肉瘤的治療需要進(jìn)一步拓展思路，尋找新的治療方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，miRNAs是近年來研究發(fā)現(xiàn)并成為研究熱點(diǎn)的一類小分子編碼RNA。miRNAa在腫瘤中有表達(dá)譜的改變[18]，miRNA可成為潛在的腫瘤診斷的生物學(xué)標(biāo)志。

目前，大部分miRNA分子都是通過與靶基因的3′UTR區(qū)域結(jié)合而發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究[19]表明，miR-432在肝癌組織或細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，過表達(dá)miR-432可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖及成瘤，其中可能的作用機(jī)制是miR-432參與了Wnt/β-catenin信號通路上某個靶基因發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。而根據(jù)Targetscan和miRbase等軟件可預(yù)測出，miR-432對應(yīng)的靶基因?yàn)槿粟吇蜃覥X3CL1，miR-432可以和CX3L1的3′UTR區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，而CX3L1是屬于趨化因子家族成員，在大部分腫瘤中表現(xiàn)為高表達(dá)水平。miR-432通過調(diào)控CX3L1基因的活性參與腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲過程的發(fā)生與發(fā)展。所以miR-432在其中發(fā)揮著抑癌的作用。而本文研究中也發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織細(xì)胞中的miR-432的表達(dá)水平顯著低于骨肉瘤旁組織(P<0.01)，與以上結(jié)論保持一致。miR-646也被證明在多種腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出低表達(dá)水平，我們通過Targetscan軟件預(yù)測其靶基因?yàn)楸砥どL因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，多個文獻(xiàn)[20-22]報(bào)道顯示，EGFR在骨肉瘤中表現(xiàn)出高表達(dá)水平，屬于一種細(xì)胞黏附因子，在大部分腫瘤如肝癌、胃癌、肺癌和宮頸癌等組織細(xì)胞中均表現(xiàn)出高表達(dá)水平，且可促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展。其可能的機(jī)制是miR-646通過與EGFR的3′UTR啟動子區(qū)域結(jié)合調(diào)節(jié)了EGFR的活性，從而參與了骨肉瘤的增殖與轉(zhuǎn)移的過程，發(fā)揮著抑癌作用。而本文研究中也發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織細(xì)胞中的miR-646的表達(dá)水平顯著低于骨肉瘤旁組織(P<0.01)，與以上結(jié)論保持一致。另一種miRNA即miR-100在骨肉瘤組織細(xì)胞中表達(dá)也是顯著降低(P<0.01)。相關(guān)研究報(bào)道顯示，miR-100可通過靶基因于Polo樣激酶(polo-like kinase 1，PLK1)的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同樣，PLK1在多種腫瘤中均表現(xiàn)出高表達(dá)水平，且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的作用，發(fā)揮著促癌的作用，因此，miR-100通過調(diào)節(jié)PLK1的活性，發(fā)揮著抑癌作用[23]。在研究miRNA與臨床病理參數(shù)的關(guān)系中，我們發(fā)現(xiàn)miR-432、miR-646和miR-100均與TNM分期和是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P<0.05～P<0.01)，說明miR-432、miR-646和miR-100與骨肉瘤的增殖與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-432、miR-646和miR-100的表達(dá)水平之間均具有正相關(guān)。其可能的作用機(jī)制均為miR-432、miR-646和miR-100通過“海綿效應(yīng)”，在mRNA水平分別與EGFR、PLKK1等靶基因相結(jié)合，而靶基因通過多種代謝途徑調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖與發(fā)展，從而達(dá)到miRNA影響了腫瘤細(xì)胞在病人體內(nèi)的變化的作用。但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，miR-432、miR-646和miR-100在原發(fā)性骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，不僅僅對于骨肉瘤早期的診斷和治療具有重要的臨床意義，對于骨肉瘤病人的預(yù)后提供了理論支持，但是miR-432、miR-646和miR-100的相互作用仍需要深入探討。