張莉娜,武世伍

近幾十年來，隨著人們生活方式的改變以及激素的過度使用，乳腺癌的發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)在逐年提升，已成為全球發(fā)病人數(shù)第二高的惡性腫瘤[1]，在我國也是最常見的惡性腫瘤之一[2]。浸潤性乳腺癌(infiltrating breast carcinoma，IBC，非特殊型)是乳腺癌中最常見的組織學(xué)類型。盡管近年來各種新的治療方法和技術(shù)層出不窮，但I(xiàn)BC病人總的生存時(shí)間并沒有顯著提高，這可能與IBC病人術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有關(guān)?？谇话┻^表達(dá)蛋白1(oral cancer overexpressed protein 1，ORAOV1)最初是從口腔鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)候選癌基因，其定位于人染色體11q13。ORAOV1參與細(xì)胞周期、凋亡及血管生成等生物學(xué)活動(dòng)[3-4]。ORAOV1蛋白表達(dá)異常增高常常與腫瘤細(xì)胞增殖快、分化差、預(yù)后不良等密切相關(guān)[5]。腫瘤組織通過誘導(dǎo)大量新生血管形成促進(jìn)其快速生長，并進(jìn)一步促進(jìn)其發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，從而增加病人術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的概率。血管生成抑制因子1(vasohibin 1，VASH1)是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種關(guān)于血管生成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子[6]，該因子主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)及血小板源性生長因子(PDGF)等共同刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的，并負(fù)反饋性地抑制血管生成[7-8]。但是，越來越多的研究[9]表明VASH1高表達(dá)卻常常意味著病人預(yù)后不良。本研究旨在通過免疫組織化學(xué)EliVisionTMplus法尋找能夠預(yù)測IBC病人術(shù)后浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的生物預(yù)測因子，為臨床治療提供一點(diǎn)線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 239例IBC標(biāo)本(IBC組)和100例相應(yīng)的癌旁正常乳腺組織(對(duì)照組)收集自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，手術(shù)時(shí)間為2008-2010年；術(shù)前有過新輔助放、化療或生物治療病史的病例均被排除。所有病人均有完整的臨床、病理資料以及術(shù)后總的生存時(shí)間資料，隨訪時(shí)間從手術(shù)日期開始，截至2015年12月或死亡(通過打電話、E-mail以及微信等隨訪)。隨訪時(shí)間為9～91個(gè)月。病人年齡27～77歲。所有入選的IBC組織和正常乳腺組織均經(jīng)病理科醫(yī)師再次閱片證實(shí)。

1.2 試劑 兔抗人ORAOV1多克隆抗體(ab211446，濃縮液，稀釋比1∶150)、VASH-1多克隆抗體(ab199732，濃縮液，稀釋比1∶100)購自美國Abcam生物有限公司；EliVisionTMplus及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)中所有石蠟包埋標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，再經(jīng)過連續(xù)4 μm厚切片等過程，最后經(jīng)過二甲苯溶液脫蠟及梯度濃度的乙醇溶液脫二甲苯至水洗。免疫組織化學(xué)步驟按照EliVisionTMplus試劑盒說明步驟進(jìn)行；ORAOV1和VASH1蛋白的染色步驟均根據(jù)各自要求進(jìn)行，陽性對(duì)照片用已知陽性切片，空白對(duì)照用同種屬的IgG替代。

1.4 結(jié)果判定 ORAOV1蛋白陽性染色定位于細(xì)胞核，VASH-1蛋白陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)和膜，相應(yīng)部位出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]中介紹的陽性結(jié)果判定依據(jù)：將染色強(qiáng)度和染色范圍來分別計(jì)分，然后將陽性強(qiáng)度得分和陽性范圍得分相乘，得出一個(gè)0～12分的積分值范圍。根據(jù)參考文獻(xiàn)中的結(jié)果劃分，將積分≥3分判定為陽性，<3分判定為陰性。所有的病理閱片結(jié)果均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師通過獨(dú)立雙盲法獲得。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)、Speaman等級(jí)相關(guān)、生存分析(采用Kaplan-Meier方法)及l(fā)og-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IBC組織中VASH1蛋白的陽性結(jié)果情況及臨床意義 VASH1蛋白在對(duì)照組中的陽性率為12.0%(12/100),低于在IBC組的56.9%(136/239)(χ2=57.79，P<0.01)(見圖1A、1B)。對(duì)IBC組VASH1蛋白陽性率與臨床病理因素之間的關(guān)系分析顯示，與組織的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織的大小均有關(guān)系(P<0.05～P<0.01)，與IBC病人的年齡及腫瘤位置等之間均無相關(guān)性(P>0.05)(見表1)。

2.2 IBC組織中ORAOV1蛋白的陽性結(jié)果情況及臨床意義 對(duì)照組中ORAOV1蛋白的陽性率13.0%(13/100)低于IBC組中58.2%(139/239)(χ2=58.13，P<0.01(見圖1C、1D)。對(duì)IBC組ORAOV1蛋白陽性率與臨床病理因素之間的關(guān)系分析顯示，與年齡組、腫瘤位置均無關(guān)系(P>0.05)，隨著IBC組織的分化越差、腫瘤組織越大，ORAOV1蛋白的陽性率也越高(P<0.01)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的ORAOV1蛋白的陽性率明顯高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組(P<0.01)，高TNM分期組中的ORAOV1蛋白的陽性率明顯高于低TNM分期組(P<0.01)(見表1)。

表1 IBC中ORAOV1和VASH1的表達(dá)及其與臨床各病理因素之間的關(guān)系[n；百分率(%)]

2.3 IBC組織中ORAOV1蛋白和VASH1蛋白之間的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，在IBC組織中ORAOV1蛋白的陽性率與VASH1蛋白的陽性率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.512，P<0.01)，ORAOV1蛋白的陽性率與ER及PR蛋白之間無相關(guān)性(r=-0.089、0.104，P>0.05)，與HER2蛋白呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.131，P<0.05)；VASH1蛋白與ER蛋白呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.195，P<0.01)，與PR及HER2蛋白無相關(guān)性(r=-0.021、0.065，P>0.05)。

2.4 COX多因素回歸分析 將本研究中涉及到所有臨床病理參數(shù),包括年齡、腫瘤長徑、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、ER、PR、HER2、ORAOV1及VASH1等因素全部帶入COX多因素模型進(jìn)行分析，結(jié)果表明陽性表達(dá)的ORAOV1和VASH1蛋白、腫瘤長徑和TNM分期高低是影響IBC病人術(shù)后總生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05～P<0.01)(見表2)。

表2 COX多因素分析

2.5 生存分析 本研究中總的5年生存率約為35.6%(85/239)。Kaplan-Meier法生存分析表明ORAOV1蛋白陽性組中位生存時(shí)間為(44.8±15.2)個(gè)月，低于陰性組的(61.7±13.6)個(gè)月(χ2=53.39，P<0.01)(見圖2A)；VASH1蛋白陽性組為(45.0±14.1)個(gè)月，低于陰性組的(61.0±15.6)個(gè)月(χ2=49.60，P<0.01)(見圖2B)；ER蛋白陽性組為(53.9±17.7)個(gè)月，低于陰性組的(48.6±14.6)個(gè)月(χ2=8.98，P<0.01),(見圖2C)；PR蛋白陽性組為(52.0±17.5)個(gè)月，與陰性組為(51.7±15.9)個(gè)月差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.17，P>0.05)(見圖2D)；HER2蛋白陽性組為(48.0±16.9)個(gè)月，低于陰性組的(54.6±16.2)個(gè)月(χ2=5.11，P<0.05)(見圖2E)。

3 討論

近年來，罹患乳腺癌的人數(shù)不斷增加，且年齡不斷年輕化，因此，迫切需要尋找能早期診斷、預(yù)測其浸潤和轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子。ORAOV1是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的癌基因，研究表明它是人染色體11q13區(qū)域基因擴(kuò)增的主要驅(qū)動(dòng)因子[3]。在多種腫瘤的發(fā)生過程中，ORAOV1在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成方面起著重要作用[4-5,11-12]。本研究主要通過免疫組織化學(xué)方法檢測ORAOV1蛋白在IBC組織及其相應(yīng)的癌旁正常對(duì)照組中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在IBC組織中ORAOV1蛋白的陽性率顯著高于對(duì)照組；且ORAOV1蛋白陽性率的高低差異在IBC組織的不同分化程度、TNM分期高低等之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中ORAOV1蛋白的陽性率顯著高于其在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中的，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，ORAOV1蛋白表達(dá)的異常增高可能參與了IBC的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程，與其他學(xué)者[13-14]的結(jié)果相一致。

VASH1是一個(gè)由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的特異性的抑制血管新生的蛋白，其位于人染色體14q24.3，包含7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子。VASH1蛋白可以在人體許多器官中表達(dá)，但在腦和胎盤組織中最常見。在體外實(shí)驗(yàn)中，VASH1蛋白可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、并促使其凋亡[15]；VASH1能夠抑制由VEGF和FGF2誘導(dǎo)的血管形成[6]，并且還可以抑制淋巴管生成[8]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在IBC組中VASH1蛋白陽性率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且隨著IBC組織的分化越差、腫瘤組織越大，VASH1蛋白的陽性率也越高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中VASH1蛋白的陽性率顯著高于其在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中，VASH1蛋白的陽性率在高TNM分期組中顯著高于其在低TNM分期組中，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IBC組織為滿足其快速增殖的需要，分泌大量VEGF和FGF2等因子促進(jìn)血管形成，而VASH1蛋白的水平主要受到VEGF和FGF2的調(diào)控的血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，并負(fù)反饋性的抑制血管形成，因此VASH1的水平升高反而意味著腫瘤組織增殖快、分化差、易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后差，與文獻(xiàn)[9,13,16]報(bào)道一致。

復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是IBC病人治療失敗最主要的原因。盡管TNM分期能夠?yàn)槊總€(gè)病人的治療方案提供一個(gè)總的策略，但是其不能全面地反映每個(gè)腫瘤病人的異質(zhì)性及具體的生物學(xué)行為，因此，迫切需要尋找到一些能夠預(yù)測IBC病人生物學(xué)行為及異質(zhì)性的分子標(biāo)志物。本研究總的生存分析發(fā)現(xiàn)，IBC病人總的5年生存率為35.6%。ORAOV1蛋白、VASH1蛋白和HER2蛋白陽性組IBC病人術(shù)后總的生存時(shí)間明顯低于其陰性組病人；ER陽性組病人的術(shù)后總的生存時(shí)間明顯高于其陰性組病人，log-rank分析表明差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析表明陽性表達(dá)的ORAOV1和VASH1蛋白、腫瘤長徑及TNM分期高低是影響IBC病人術(shù)后總的生存時(shí)間的可能獨(dú)立預(yù)后因素。Spearman等級(jí)相關(guān)檢測表明ORAOV1和VASH1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，且ORAOV1蛋白還與HER2蛋白的陽性表達(dá)呈正相關(guān)，VASH1蛋白與ER蛋白的陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ORAOV1蛋白表達(dá)的異常增高參與了IBC的發(fā)生，并促進(jìn)IBC的快速增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。在腫瘤的演進(jìn)過程中，增殖的IBC細(xì)胞及其周圍的其他細(xì)胞通過分泌VEGF、FGF2和PDGF等因子誘導(dǎo)血管形成，提供充足的營養(yǎng)成分及氧以促進(jìn)IBC進(jìn)一步快速增殖，并促使IBC細(xì)胞通過新生的血管、淋巴管侵襲、轉(zhuǎn)移，而VEGF、FGF2及PDGF等同時(shí)能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞合成VASH1，負(fù)反饋性的抑制血管形成，從而導(dǎo)致部分腫瘤組織由于生長過快、且又無法獲得足夠的營養(yǎng)和氧而發(fā)生壞死。由于病人體內(nèi)的VASH1水平與VEGF、FGF2及PDGF水平相關(guān)，因此VASH1高表達(dá)反而意味著預(yù)后差。盡管本研究通過免疫組織化學(xué)方法得出一些有用的結(jié)果，但是手段和方法比較單一，希望在以后的研究中，能通過相關(guān)的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果。

綜上所述，ORAOV1蛋白的異常表達(dá)參與了IBC發(fā)生，可能與VASH1協(xié)同促進(jìn)IBC的發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程。因此，可以通過聯(lián)合檢測IBC病人腫瘤組織中ORAOV1和VASH1蛋白表達(dá)情況，作為預(yù)測其可能發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的可能指標(biāo)之一。