繆晨婷，錢 靜，朱 璟

卵巢癌發(fā)病隱匿、不易察覺，多數(shù)病人發(fā)現(xiàn)時處于中晚期且伴隨轉(zhuǎn)移[1]，導(dǎo)致多數(shù)病人預(yù)后不佳[2]。因此提高卵巢癌的早期診斷極為重要。但由于卵巢癌發(fā)病機(jī)制不明確，要提高早期診斷，還需從卵巢癌的發(fā)生機(jī)制入手。炎癥在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)是炎性細(xì)胞因子重要組成部分，對免疫細(xì)胞成熟、增殖、分化等一系列過程具有調(diào)節(jié)作用。IL-33是IL-1的家族成員，以前體蛋白的形式存在于多種組織細(xì)胞核中，磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase，ST2)是IL-33的高親和力受體[4]。IL-33/ST2信號通路可誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞活化，使促癌或抗癌細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境中募集[5]。然而，IL-33在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程機(jī)制仍未清楚，是否通過ST2受體發(fā)揮作用也未明確。本研究從IL-33從發(fā)，探究IL-33/ST2對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，旨在進(jìn)一步揭示卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，為卵巢癌的臨床基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 人卵巢癌細(xì)胞系ES-2細(xì)胞購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞所；IL-33購自英國Abcam公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶、脂質(zhì)體2000均購自賽默飛世爾有限公司；二甲基亞砜購自美國sigma公司；MTT、Transwell小室、Matrigel 基質(zhì)膠均購自美國Millipore公司；雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑購自美國Biolegend公司；青鏈霉素雙抗溶液購自江蘇恩莫阿賽生物公司；多聚甲醛和結(jié)晶紫染色液均購自碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將卵巢癌ES-2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清-青鏈霉素雙抗溶液)，置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，據(jù)細(xì)胞的生長速率每2天更換培養(yǎng)基，用0.25%的胰蛋白酶每隔2～3 d進(jìn)行消化、傳代，收集對數(shù)生長期ES-2細(xì)胞。

1.2.2 MTT實驗 MTT法檢測IL-33和si-ST2對ES-2人卵巢癌細(xì)胞后的存活率的影響：取處于對數(shù)生長期ES-2細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，細(xì)胞計數(shù)，將ES-2細(xì)胞種到6板孔中，密度為3×105/孔，分組為：對照組、IL-33組、IL-33+si-ST2組、si-ST2組，IL-33質(zhì)量濃度60 ng/L、si-ST2用量為每孔50 pmol。轉(zhuǎn)染的步驟按照Lipofectamine 2000 的說明書進(jìn)行操作，24 h后消化細(xì)胞，計數(shù)，將細(xì)胞鋪板到96孔板，加入濃度為60 ng/L的IL-33，在檢測時間點(diǎn)時，每孔加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，避免吸去紫色結(jié)晶，每孔加150 μL二甲基亞砜，進(jìn)行10 min低速振蕩，使結(jié)晶物充分溶解，采用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀對波長490 nm時每個孔的吸光度實施測定，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)實驗 取對數(shù)生長期ES-2細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，將ES-2細(xì)胞種到6孔板中，孔密度2.5×105，按照分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染si-ST2，轉(zhuǎn)染的步驟按照Lipofectamine 2000 的說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染24 h后，加入60 ng/L的IL-33。48 h后收集細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷PBS洗滌2次，然后用500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為106/mL，取100 μL細(xì)胞懸浮于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-APC混勻后，加入5 μL Propidiμm Iodide(PI)混勻，于室溫避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 細(xì)胞遷移實驗 接種ES-2細(xì)胞至24孔板，待細(xì)胞貼壁鋪滿后利用槍頭劃痕，分別加入IL-33(60 ng/L)、si-ST2(每孔50 pmol)刺激后，分別在0、24 h時間點(diǎn)取樣，拍照。在Adobe Illustrator(AI)軟件里面量出不同時間不同分組劃痕的寬度；細(xì)胞遷移率=(0 h細(xì)胞間距-24 h細(xì)胞間距)/0 h細(xì)胞間距×100%。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實驗 接種ES-2細(xì)胞至Matrigel基質(zhì)膠(9∶1)，Matrigel稀釋液平鋪于Transwell 小室上室，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液(600 μL)，上室分別加入IL-33(60 ng/L)、si-ST2(每孔50 pmol)刺激10 h后，去除上層未穿過濾膜的細(xì)胞，保留濾膜下層細(xì)胞，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡視野下拍照細(xì)胞計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗檢測si-ST2對IL-33作用ES-2卵巢癌細(xì)胞的影響 IL-33組、si-ST2組、IL-33+si-ST2組以及對照組的細(xì)胞存活率的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。其中IL-33組細(xì)胞存活率高于對照組(P<0.01)，si-ST2組細(xì)胞存活率低于對照組(P<0.01)；但I(xiàn)L-33+si-ST2組細(xì)胞存活率與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IL-33+si-ST2組細(xì)胞存活率顯著高于si-ST2組；IL-33組細(xì)胞存活率顯著高于si-ST2組(P<0.01)(見表1)。

表1 不同組間細(xì)胞存活比較

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-33和si-ST2對ES-2卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響 對照組、IL-33組、si-ST2組以及IL-33+si-ST2組流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，在ES-2細(xì)胞中，IL-33組細(xì)胞凋亡率低于對照組；si-ST2組細(xì)胞凋亡率高于對照組和IL-33組；IL-33+si-ST2組細(xì)胞凋亡率低于si-ST2組，高于IL-33組(見圖1、表2)。

表2 ES-2凋亡數(shù)據(jù)表(%)

2.3 IL-33和si-ST2對ES-2卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 IL-33組、si-ST2組、IL-33+si-ST2組以及對照組的細(xì)胞遷移率、侵襲率的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中IL-33組細(xì)胞遷移率、侵襲率均低于對照組，si-ST2組遷移、侵襲均高于對照組，IL-33+si-ST2組遷移、侵襲均高于IL-33組，低于si-ST2組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖2、圖3及表3)。

表3 不同組間細(xì)胞遷移率、侵襲率的比較

3 討論

腫瘤發(fā)展不僅包括癌細(xì)胞本身，還有其他相關(guān)組成部分，如基質(zhì)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞，特別在卵巢癌腹水和基質(zhì)交換過程中，會伴隨淋巴細(xì)胞群的相關(guān)因子變化，促進(jìn)癌細(xì)胞生長、擴(kuò)散[6]。另外癌細(xì)胞本身產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子也能通過自分泌方式，促進(jìn)其本身增長，抑制凋亡?？梢?，炎癥似乎和腫瘤的每一步都有關(guān)聯(lián)，包括腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)亡、遷移、侵襲[7]。因為炎性因子的刺激，會造成線粒體損傷，降低細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性，增加活性氧的產(chǎn)生，破壞生物大分子(DNA、蛋白質(zhì))，導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞[8]，當(dāng)細(xì)胞的基因發(fā)生點(diǎn)突變、缺失或重組，即可誘發(fā)腫瘤[9]。IL-33作為新發(fā)現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子，可通過IL-33/ST2信號通路，作用于含有ST2受體的細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子，發(fā)揮促增殖作用。有文獻(xiàn)[10]表明IL-33和ST2在卵巢腫瘤中表達(dá)上調(diào)。胡霞等[11]研究表明IL-33可促進(jìn)食管腺癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制是IL-33通過IL-33/ST2信號通路，作用于含有ST2受體的細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌相關(guān)炎性因子，發(fā)揮促癌細(xì)胞增殖、遷移作用。LI等[12]研究表明IL-33可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制是IL-33通過其受體ST2發(fā)揮作用，同時經(jīng)NF-κB信號上調(diào)環(huán)氧化酶2的表達(dá)，促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖、遷移。這些研究均表明IL-33是通過ST2通路發(fā)揮促癌細(xì)胞發(fā)展作用,但其在卵巢癌的作用尚不清楚。

本研究采用MTT實驗發(fā)現(xiàn)IL-33組細(xì)胞存活率高于對照組，si-ST2組細(xì)胞存活率低于對照組，IL-33+si-ST2組細(xì)胞存活率顯著高于si-ST2組；IL-33組細(xì)胞存活率顯著高于si-ST2組(P<0.01)。表明了IL-33促進(jìn)ES-2卵巢癌細(xì)胞增殖，si-ST2抑制增殖，轉(zhuǎn)染si-ST2后再加入IL-33處理后，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)。在流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-33和si-ST2對ES-2卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-33處理組細(xì)胞凋亡率低于對照組；si-ST2組細(xì)胞凋亡率高于對照組和IL-33組；IL-33+si-ST2組細(xì)胞凋亡率低于si-ST2組，高于IL-33組(P<0.01)。表明了在卵巢癌ES-2細(xì)胞中，IL-33抑制細(xì)胞凋亡，si-ST2促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究的遷移、侵襲實驗發(fā)現(xiàn)IL-33組細(xì)胞遷移率、侵襲率均低于對照組，si-ST2組遷移、侵襲均高于對照組，IL-33處理+si-ST2組遷移、侵襲均高于IL-33處理組，低于si-ST2組(P<0.01)。IL-33可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，并可抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲能力。而沉默ST2可抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲能力，ST2沉默處理后再加入IL-33處理，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，而細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲能力受到抑制。說明在卵巢癌ES-2細(xì)胞中，IL-33對其生物學(xué)特性的影響是通過ST2受體途徑而實現(xiàn)的。究其原因：IL-33在腫瘤微環(huán)境下，被分泌到胞外與受體ST2 結(jié)合，通過IL-33/ST2信號通路作用于腫瘤微環(huán)境中的含有ST2 受體的細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子[13]。同時將信號轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，把MyD88蛋白招募過來[14]，并通過MyD88通路的IRAK1、IRAK4和TRAF6，降解IκB蛋白(NF-κB的抑制性蛋白)，隨后激活NF-κB、MAPK、p38以及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)[13，15]，同時激活下游轉(zhuǎn)錄因子激活子蛋白-1(Activator protein 1,AP-1)。NF-κB是一種可與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異性結(jié)合的核蛋白因子[16]，具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，當(dāng)活化的NF-κB與相應(yīng)κB序列結(jié)合后，啟動和調(diào)節(jié)增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；MAPK通路是細(xì)胞增殖、凋亡等信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；而p38途徑通過上調(diào)某些轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，則會影響癌細(xì)胞的增殖，JNK途徑中活化的JNK與激活轉(zhuǎn)錄因子2(ATF2)及c-Jun的氨基末端區(qū)域結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄因子的活性區(qū)域發(fā)生磷酸化[17]，JNK的同二聚體或異二聚體與基因啟動子上的AP-1 位點(diǎn)結(jié)合，提高AP-1轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成，使內(nèi)皮細(xì)胞活化，腫瘤細(xì)胞更容易穿透內(nèi)皮，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸或結(jié)合，從而參與腫瘤遷移、侵襲等過程。這也說明了IL-33是可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，但ST2沉默后，IL-33無法與ST2受體結(jié)合發(fā)揮促增殖作用，因此si-ST2屬促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

綜上，IL-33可促進(jìn)卵巢癌ES-2細(xì)胞增殖并抑制其凋亡、遷移、侵襲，沉默ST2可抑制卵巢癌ES-2細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡,使其遷移和侵襲能力下降，ST2沉默處理后再加入IL-33處理，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，但細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲能力受到抑制。IL-33通過ST2途徑參與影響卵巢癌ES-2細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。