王旋宇，朱永娜，薛 魁，武慶華，姜麗娜，朱晨晨，張曉東

年輕恒牙在發(fā)育過程中，常由于各種有害刺激、解剖變異等導(dǎo)致牙髓暴露，牙根發(fā)育受限[1]。相對于牙髓治療，以替代或修復(fù)病損區(qū)細(xì)胞為主的干細(xì)胞療法成為一種理想的治療方案[2]。根尖牙乳頭干細(xì)胞(stem cells from the apical papilla,SCAP)是生長在恒牙牙乳頭內(nèi)的新型干細(xì)胞群體，該細(xì)胞具有集落形成、自我更新、多分化及抗感染的優(yōu)越性，是牙根牙本質(zhì)再生的種子細(xì)胞[3]。當(dāng)牙髓炎及根尖炎發(fā)生時，炎性環(huán)境及炎性因子的存在致使牙根發(fā)育停止，SCAP介導(dǎo)的牙本質(zhì)再生功能受限，表明炎性因子可以影響SCAP的特性[4]。

白細(xì)胞介素-34(interleukin-34，IL-34)是一種具有復(fù)雜生物學(xué)特性的炎性因子，它可以刺激破骨細(xì)胞的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥區(qū)域的骨吸收[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)IL-34在牙周炎和種植體周圍炎中高表達(dá)，參與牙周組織破壞過程；另有研究[7]發(fā)現(xiàn)IL-34在慢性根尖周病損組織中高表達(dá)，參與根尖炎癥反應(yīng)過程，但炎性環(huán)境中的IL-34是否作用于SCAP，尚鮮見研究報道。本研究通過不同濃度的IL-34作用于SCAP,探究IL-34對SCAP增殖能力的影響，從而進(jìn)一步了解炎性壞境中SCAP特性的改變，為臨床治療年輕恒牙牙髓炎、根尖炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 青鏈霉素混合液，高糖培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清FBS(美國Gibco)；IL-34(上海滬震)；CD24單克隆抗體(美國BD)；茜素紅染液(美國sigma)；MTT(德國BioFROXX)；流式細(xì)胞儀(美國BD-FACSVerse)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific 8000)；光學(xué)顯微鏡、倒置拍照顯微鏡(德國萊卡)，低速離心機(jī)(上海盧湘儀)，酶標(biāo)檢測儀(美國MDC)。

1.2 方法

1.2.1 SCAP的分離培養(yǎng) 經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，取2只2～3周齡的SD大鼠，水合氯醛麻醉致死，將根尖牙乳頭組織從根尖分離，PBS清洗后，無菌剪刀剪碎，置于3 mg/mL的膠原酶和4 mg/mL的dispase酶中，37℃的環(huán)境下消化30 min，在含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)基中生長到70%的融合率，按1∶3的比例用酶消化法傳代。

1.2.2 SCAP的鑒定

1.2.2.1 流式細(xì)胞儀鑒定SCAP表面標(biāo)志物 CD24是SCAP的特征性標(biāo)志物，在SCAP中優(yōu)先表達(dá)，而在其他間充質(zhì)干細(xì)胞中不表達(dá)[8]。故本研究收集第3代SCAP，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為107個/毫升，離心，沉淀后，加入含CD24的100 μL的染色緩沖液，對應(yīng)孔加入含IgM的100 μL的染色緩沖液,放置4 ℃冰箱避光孵育30 min。洗滌、重懸細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)定量檢測。

1.2.2.2 茜素紅染色鑒定SCAP分化潛能 取第3代SCAP，以5×104個/孔接種到12孔板中，以FBS為10%的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞融合率達(dá)到70%時，更換成骨誘導(dǎo)液。成骨誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色。

1.2.3 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)實驗檢測SCAP增殖能力 調(diào)整SCAP密度為2×103個/孔，隨機(jī)分為對照組和實驗組6組，分別接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔液體體積200 μL，待細(xì)胞貼壁后饑餓24 h，實驗組加入含IL-34的培養(yǎng)液，濃度分別為25、50、100、200、400、600 ng/mL，每個濃度梯度3個復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)的第1、3、5、7、9天，酶標(biāo)儀492 nm波長測出同一時間點吸光度值，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 SCAP的形態(tài)學(xué)特征 分離出的大鼠根尖牙乳頭呈條索狀，原發(fā)性SCAP在培養(yǎng)5～7 d后呈現(xiàn)典型的細(xì)胞集落，顯微鏡下大部分SCAP呈梭形(見圖1)。

2.2 SCAP的鑒定 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，第3代SCAP表達(dá)CD24為90.7%，呈陽性表達(dá)(見圖2)。成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色，鏡下見鈣鹽沉積(見圖3)。

2.3 不同濃度IL-34對SCAP增殖的影響 通過MTT實驗測得各組不同時間細(xì)胞吸光度值，結(jié)果顯示，第1天600 ng/mL組低于對照組；第3天50 ng/mL組和100 ng/mL組高于對照組，400 ng/mL組和600 ng/mL組低于對照組；第5天和第7天25 ng/mL組、50 ng/mL組和100 ng/mL組高于對照組，400 ng/mL組和600 ng/mL組低于對照組；第9天25 ng/mL組、50 ng/mL組和100 ng/mL組高于對照組，200 ng/mL組、400 ng/mL組和600 ng/mL組低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 3組濃度的IL-34對SCAP增殖能力具有促進(jìn)作用，其中50 ng/mL實驗組對SCAP增殖作用最顯著，達(dá)到峰值；200 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL 3組濃度的IL-34抑制SCAP的增殖能力，尤以600 ng/m L實驗組對SCAP的抑制作用最顯著(見表1)。

表1 不同濃度IL-34各組吸光度值比較

3 討論

在未發(fā)育完全的牙齒中，根尖牙乳頭代表著一個豐富的干細(xì)胞池，其中存在的SCAP作為一種外間充質(zhì)細(xì)胞，在牙髓完全喪失的情況下，可以遷移到髓腔，促進(jìn)牙髓再生[9]，且該細(xì)胞來源于早期成牙本質(zhì)細(xì)胞，有效促進(jìn)牙根再生[10]。研究[3，11]發(fā)現(xiàn)，與其他干細(xì)胞相比，SCAP具有快速增殖、誘導(dǎo)生物遷移和礦化的能力，然而SCAP的特性卻受到炎性環(huán)境等因素影響,TOBIAS DUARTE等[12]研究了牙髓感染后根尖牙乳頭的組織學(xué)狀況，發(fā)現(xiàn)牙髓暴露后，炎性因子的釋放導(dǎo)致根尖牙乳頭組織紊亂，SCAP活力降低。IL-34是2008年發(fā)現(xiàn)的新型炎性因子，該因子在牙周膜細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)[13-14]，并在根尖周炎癥組織中高表達(dá)，因此探討IL-34對SCAP增殖能力的影響對臨床具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)低濃度的IL-34對SCAP增殖能力具有顯著的促進(jìn)作用，其中50 ng/mL的IL-34對SCAP增殖的促進(jìn)作用最顯著，SéGALINY等[15]研究了IL-34對集落形成樣內(nèi)皮前體細(xì)胞(ECFCs)的影響，發(fā)現(xiàn)IL-34可有效促進(jìn)ECFCs增殖，最佳增殖濃度為50 ng/mL。這與本實驗研究結(jié)果一致，提示50 ng/mL的IL-34可能為細(xì)胞增殖的最佳濃度。

IL-34在病理生理狀態(tài)下具有潛在致病性[16]，BATRA等[17]研究發(fā)現(xiàn)IL-34在慢性牙周炎和侵襲性牙周炎病人的齦溝液中高表達(dá)，HWANG等[18]也發(fā)現(xiàn)IL-34在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的滑膜組織和滑液中高表達(dá)，并與滑膜炎的嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)隨著IL-34濃度的增加，其對SCAP的增殖作用逐漸減弱，并在濃度達(dá)到200 ng/mL時抑制SACP的增殖，且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。

IL-34作為根尖炎性環(huán)境中的促炎因子之一，與炎性因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)關(guān)系密切。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的滑膜組織中，IL-34作為TNF-α的下游效應(yīng)因子調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致炎癥和骨侵蝕[18]。在干燥綜合征中，IL-34與TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)[19]。LIU等[20]曾研究TNF-α對SCAP增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)10 ng/mL的TNF-α對SCAP的增殖作用顯著增強(qiáng)。YANG等[21]也發(fā)現(xiàn)10 ng/mL的TNF-α可以提高SCAP的增殖潛能。本研究結(jié)果與前述研究相似，發(fā)現(xiàn)低濃度的炎性因子IL-34促進(jìn)SCAP增殖，提示在炎癥的早期階段，IL-34可能是干細(xì)胞抵御外界刺激的屏障之一，然而IL-34在低濃度時對SCAP增殖能力的促進(jìn)作用是否與TNF-α有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明炎性因子IL-34對SCAP的增殖能力有一定的影響，為臨床治療年輕恒牙牙髓炎、根尖周炎提供一定的指導(dǎo)意義，但其發(fā)生的具體機(jī)制，還需后續(xù)實驗進(jìn)一步研究。