李素葉，王正平，吳恒乾，韓 軍,,

(1.山東師范大學 化學化工與材料科學學院，山東濟南 250014；2.聊城高新生物技術有限公司，山東聊城 252059；3.聊城大學 生物制藥研究院，山東聊城 252059; 4.濟南大學 化學化工學院，山東濟南250022)

0 引言

藥物溶出試驗是藥物開發(fā)和生產的重要組成部分，是制藥行業(yè)在研發(fā)過程中驗證藥物釋放過程和工藝配方選擇的一種評價工具。另外，溶出試驗也用來衡量生產過程中不同批次間的一致性。因此溶出試驗具有很好的重現性和準確性，并對其可變性來源的識別變得十分重要。大多數固體口服劑型都需要進行溶出度測試，而因溶出試驗失敗(不一致的測量結果)而召回藥品的情況并不少見，但是有些溶出度測試失敗原因并不在于測試所要評估的產品質量，而是測試本身的性質。由于系統(tǒng)的復雜流體動力學特性，系統(tǒng)的再現性和準確性受到很大的影響，并且導致分析人員在系統(tǒng)的研究、校正和重新驗證上浪費了大量的時間。所以為了避免出現這樣的失敗，可以通過減小溶出裝置的物理參數對溶出試驗變異性的影響，特別是因溶出裝置的缺陷，而與產品的實際性能無關而造成的失敗[1-4]。

溶出試驗裝置是模擬人體消化道器官，轉籃和槳板以及轉速是模擬胃部和小腸的蠕動。目前溶出儀有籃法、槳法、小杯法、槳碟法、轉筒法、往復筒法、流池法等[5]。最常用的溶出試驗設備是槳法和籃法，這兩種設備涵蓋了制藥工業(yè)的大部分溶出測試。USP <711>部分對槳法和籃法進行了詳細描述，包括儀器設備、溶出程序和產品規(guī)格等[6]?；@法和槳法適用于普通制劑、緩釋制劑和控釋制劑，具有裝置簡單、耐用及標準化的特點。特別是槳法是制藥行業(yè)中常用的溶出測試設備，盡管其被廣泛使用，溶出測試仍然容易出現重大錯誤和測試失敗。一些研究者已經指出，溶出杯中的流體動力學可能是溶出測試結果不一致的原因[7]。標準USP方法除了溶出測試中的介質與產品最終暴露的環(huán)境(胃腸道環(huán)境)有很大的不同外，在溶出杯中流體力學也存在很大的差異[8]。而多篇文獻已經研究證明了流體動力學影響溶出試驗的性能， Morihara 等人通過籃法，槳法，流通池法等對溶出儀校準標準片水楊酸片(非崩解型)溶出試驗，研究了片劑周圍的流體動力學情況，表明以研究體外/體內關系和質量控制為目的而選擇溶出試驗時，應考慮體外試驗之間流體力學流動的差異[9]；Tahseen Mirza等人對不同溶出杯內流體動力學評估研究，有傳統(tǒng)溶出杯，尖峰溶出杯及平底溶出杯，結果表明難溶性藥物受不均一流場影響更大，由于這種流場的不均勻性，在溶解等質變過程中作為關鍵變量的應變率也在容器底部不均勻分布，反過來會對測試結果產生巨大的影響，進而影響了測試結果的重現性[10]；Bai等人通過計算模型及實驗研究，定量和詳細地研究了片劑的位置對溶出速率和整體溶出過程的影響[11，12]。以上研究提示，影響流體動力學的三個主要因素是容器形狀、操作特性和藥物在溶出杯中的分散模式和沉降位置。

隨著對溶出杯中流體動力學的深入研究，溶出設備的設計和操作可以而且應該受到挑戰(zhàn)。為提高溶出試驗的重現性，對槳法設備提出了一些改進建議并進行了研究，如傾斜的溶出杯，錐形的尖峰溶出杯(Peak vessel)[13]。這些改進，本質上，是通過改變流體動力學，占據因未被攪動的崩解顆粒在溶出杯底部形成的“死區(qū)”位置[10，14，15]。由于這些變化，溶出速率增大，測試結果變化幅度減小。在此基礎上，本文提出了對溶出設備新的改進方式，并命名為韓氏溶出法。利用新改進的溶出杯開展實例的研究，減少了傳統(tǒng)溶出杯裝置的可變性。因流體動力學與藥物在溶出杯中的分散模式和沉降位置有莫大的聯(lián)系，且難溶性藥物受此影響更大，重現性結果較差，故本文選擇難溶性藥物利托那韋片劑為典型模型開展試驗[16]。另外，由雅培公司開發(fā)的利托那韋片(Norvir，100 mg)是采用熱熔擠出工藝制備的片劑，利托那韋原料藥以無定形狀態(tài)分散于固體分散劑中，利托那韋片在與水介質接觸時形成了納米/微米級粒徑的分散體，形成一種相對穩(wěn)定的過飽和溶液。但是雅培公司在利托那韋片(Norvir，100 mg)上市兩年后發(fā)現在制劑過程中利托那韋沉淀形成了一種熱力學上更穩(wěn)定新晶型，溶解性比晶型Ⅰ更差，從而影響了制劑的溶出速率和生物利用度，造成了較大的安全風險和損失。故在利托那韋片產品開發(fā)過程中，指導利托那韋仿制藥開發(fā)時采用更具有區(qū)分力的溶出試驗尤為重要。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：智能溶出儀(Distek 7100，興和儀器有限公司)；自動取樣器(Distek 4300，興和儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Vanquish，Thermo)

試劑：利托那韋原研片(批號：1078316，雅培制藥)；磷酸二氫鉀(分析純，天津市致遠化學試劑有限公司)；磷酸(色譜純，Thremo Fisher)；甲醇(色譜純，Adamas)；乙腈(色譜純，Adamas)；試劑用水均為超純水(18.2 MΩ·cm)

1.2 改進的溶出設備

與現有傳統(tǒng)溶出杯及尖峰溶出杯類似，均包括溶出杯、溶出杯內的攪拌槳。不同之處在于，所述溶出杯的弧形底部還設置有表面圓滑的輔助攪拌珠[17]。對輔助攪拌珠的材質要求：表面無劃痕、裂縫、凹坑、污染和殘留等問題，且不易漂浮于溶劑上，所述輔助攪拌珠的直徑 < 25 mm，根據《藥物溶出度儀機械驗證指導原則》要求，攪拌槳和溶出杯底部距離25 ± 2 mm，輔助珠大于25 mm會對裝置造成損壞，本文開展實驗所使用的輔助攪拌珠的直徑約為15 mm。裝置如圖1所示。

圖1 不同溶出設備圖

1.3 溶出方法開發(fā)

利托那韋片在USP41藥典采用溶出裝置第二法槳法，以0.06 M 聚氧乙烯月桂醇醚與900 mL水混合為溶出介質，由于利托那韋片處方中本身含有聚合物和表面活性劑，片劑在接觸水介質時分散成納米/微米級粒徑的分散體，形成一種相對穩(wěn)定的過飽和溶液。為開發(fā)具有區(qū)分力的溶出方法，以水為溶出介質(預先脫氣處理)，轉速75 rmp，溫度37 ℃，溶出取樣時間點為5、10、15、20、30、45、60、90、120、150、180 min。在每個取樣時間點，儀器自動取樣3 mL，其中溶出試管中預先加入1 mL甲醇，使樣品穩(wěn)定防止樣品析出。取出樣品用斡旋振蕩器混合均勻，立即用0.45 μm濾膜(聚四氟乙烯)過濾至流動相小瓶，進液相測試其累積溶出度。難溶性藥物利托那韋片劑在傳統(tǒng)溶出杯、尖峰溶出杯、改進的溶出杯中的溶出對比考察。

1.4 對照品溶液制備

取利托那韋原料藥11 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，對照品儲備液，濃度為1.1 mg/mL。準確量取2 mL對照品儲備液，用溶出介質稀釋定容至20 mL，其中稀釋時多加入2 mL甲醇，防止樣品析出，搖勻，作為對照品溶液，濃度為0.11 mg/mL，使用液相色譜法進行檢測。

1.5 液相檢測

色譜條件為：色譜柱采用Inertsil C18柱(4.6×250 mm 5 μm)，流動相為乙腈-緩沖液(4.1 g/L的磷酸二氫鉀)55:45比例混合均勻后用磷酸調節(jié)pH至4.0 ± 0.1，流動相流速1.5 mL/min，色譜柱柱溫25 ℃，進樣體積為25 μL，檢測波長：210 nm，對對照品及樣品溶液含量檢測。

2 結果與討論

2.1 溶出方法開發(fā)

USP41藥典中介紹利托那韋溶出方法為槳法，溶出介質是在900 mL水中加入0.06 M 聚氧乙烯月桂醇醚表面活性劑。因利托那韋片處方中本身含有聚合物和表面活性劑，而溶出介質中又加入表面活性劑，所以體外溶出結果并不能夠很好的反應產品的內在品質，且不適合用于評估仿制制劑處方篩選和工藝開發(fā)，并且在仿制制劑與原研制劑體外溶出行為比較時不能很好的體現差異性，這并不是一類具有區(qū)分力的溶出度試驗[18]。基于這點，需開發(fā)能指導制劑工藝開發(fā)且具有區(qū)分力的溶出方法。2010年，Tho等人研究報道了利托那韋擠出物在水中分散時，形成不透明或稍微渾濁的納米/微米級分散體，并且在一定時間內為相對穩(wěn)定的分散體系，而分散體隨著時間的推移可能會發(fā)生締合/聚集/絮凝，變得不穩(wěn)定[19]。參考該研究，本文開發(fā)以水為溶出介質的溶出方法，并且將USP41中提出的120 min溶出取樣時間延長為180 min，考察不透明或稍微渾濁的納米/微米級分散體的穩(wěn)定性。用改進的溶出方法能夠很好的反應產品的內在品質，有效區(qū)分產品的質量差異，且指導仿制制劑的工藝開發(fā)。

2.2 改進溶出設備對溶出及重現性分析考察

采用開發(fā)的溶出方法對利托那韋原研制劑進行溶出考察時，總會出現因溶出試驗重現性不好，RSD值較大情況。通過分析失敗的溶出試驗可能并不是因原研產品質量造成的，而是測試本身的性質，系統(tǒng)復雜的流體力學變異性原因。引言部分已經強調了影響流體動力學的三個主要因素，其中藥物在溶出杯中的分散模式和沉降位置影響在利托那韋原研制劑溶出試驗明顯存在，且溶出過程觀察到溶出杯底部有堆積現象出現。而且溶出杯中本身流場存在不均勻問題，特別是溶出杯底部，此外，難溶性藥物利托那韋在水溶液中形成不透明或稍微渾濁的納米/微米級分散體，更加劇了溶出杯中流場的不均勻情況，基于此原因，批內出現溶出結果差異大，RSD值大，重現性差問題就可解釋。利托那韋原研制劑在水介質及在不同溶出設備中的溶出情況如圖2所示。由圖可知利托那韋原研制劑在不同溶出設備中的溶出趨勢基本類似，利托那韋片的溶出隨著時間的增加而上升，至60 min基本達到最大值，120-180 min區(qū)間均有下降趨勢。而且通過對比發(fā)現，不論尖峰溶出杯還是加入輔助珠的溶出杯，在60 min時普通溶出杯溶出度為88%，尖峰溶出杯及改良溶出杯溶出度分別為95%和97%，后兩者較傳統(tǒng)溶出杯溶出高，推測因尖峰和輔助珠的存在占據因未被攪動的崩解顆粒在溶出杯底部形成的“死區(qū)”位置，消除槳下的未攪拌區(qū)域干擾，消除了傳統(tǒng)溶出杯的流體力學問題。利托那韋原研制劑在不同溶出設備中的溶出重現性RSD分析結果如圖3柱狀對比圖所示。在傳統(tǒng)溶出杯中，參比制劑溶出曲線的變異系數較大，重現性較差，特別是前期(≤ 60 min)RSD 值大于15%。按照《普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》對相對標準偏差的要求“第一個取樣點的溶出量相對標準偏差不得超過20%，其余取樣時間點的溶出量相對標準偏差不得超過10%”，普通杯溶出情況不符合要求；而在尖峰溶出杯和加入輔助珠的溶出杯中，參比制劑的變異系數明顯減小，在可接受范圍內，RSD值明顯減小，反映出不論尖峰溶出杯還是對溶出設備新的改進對改善利托那韋在水溶液中納米/微米級分散體在溶出杯中的分布問題明顯改善，且相對尖峰溶出杯，加入輔助珠的RSD整體趨勢較小，溶出重現性較好。

圖2 利托那韋原研制劑在水介質及不同溶出設備中的溶出曲線?！觥瘛碓兄苿┰趯獣r間點累積溶出平均值。溶出趨勢基本一致，溶出隨著時間的增加而上升，60 min基本達到最大值,120-180 min區(qū)間有下降趨勢。圖中數據以均值 ± SD表示(n=3)

圖3 利托那韋原研制劑在不同溶出設備中的溶出重現性RSD柱狀圖對比分析。黑色柱狀圖代表原研制劑在普通溶出杯中重現性情況，RSD值很大，表明重現性差。紅色和藍色分別代表原研制劑在尖峰溶出杯和加輔助珠溶出杯溶出重現性情況，RSD值較小，符合《普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》相對標準偏差的要求

2.3 改進溶出設備優(yōu)勢分析

在不需要對溶出儀重新進行機械驗證的前提下，添加輔助攪拌珠使得溶出杯底部不存在溶出死角問題，并改善了溶出杯中流場不均勻問題。通過改進的溶出裝置減小溶出裝置的物理參數對溶出試驗的變異性影響，可大幅度提升重現性，避免了因測試本身的性質導致溶出試驗的失敗，從而進一步滿足質量控制的要求，以保證研究者獲得更好的體內外相關性?；跈C械方面優(yōu)勢考量，加入輔助珠方式對溶出設備改進是在原槳法設備的基礎上無損改進，既保留了槳法裝置簡單、耐用及標準化的特點，又解決對溶出試驗的變異性影響問題。并且改進的溶出試驗裝置中所用的輔助珠，其材質耐用、不易被腐蝕、不易浮動、不易與藥品產生反應，容易標準化和量產。

3 結論

本文通過對難溶性藥物利托那韋溶出試驗考察及RSD分析，很直觀的表明了改善后溶出裝置對其有利作用，也對改進的溶出設備的優(yōu)勢進行剖析匯總。但是在評估和理解流體在改進的溶出設備內的流體動力學還需進行深入研究。另外在不同品種的溶出實驗中，輔助珠的使用數量，甚至尺寸都可能對溶出裝置的物理參數產生影響，進而對溶出實驗的變異性產生多變影響。這一點對固定錐形-尖峰溶出杯來說，加入輔助珠更具靈活可變性，同時也可以適用于籃式等其他溶出方法。對溶出裝置的改善，減少了傳統(tǒng)溶出裝置的可變性。

溶出技術作為一種性能測試將繼續(xù)為制藥工業(yè)增加價值，該方法正在通過科學過程進行演變。在不久的將來，溶出方法的差異將會減少，能夠對藥品的內在品質更加有效評估，能夠指導新配方開發(fā)和評估批次間的一致性，確保產品質量，并且這一技術的生物相關性也將會提高，從而大幅度提高生物等效性試驗成功概率，推動藥品生產企業(yè)對制劑工藝的充分、詳盡研究。