羅新惠，張立春，劉艷光,2，柳儉強(qiáng)，翟 博，曹 陽(yáng)，張明新，金海國(guó)

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物生物技術(shù)研究所，吉林 公主嶺 136100；2.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉130021)

胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝等多種生理功能[1]，參與了畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖及產(chǎn)奶等多種表型構(gòu)成[2-4]，在動(dòng)物毛囊發(fā)育及毛發(fā)生長(zhǎng)中也起到重要作用。研究表明IGF1在綿羊、鼠和人等多種哺乳動(dòng)物及禽類的皮膚和毛囊中均有表達(dá)并有助于毛干的伸長(zhǎng)[5]。毛囊的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)IGF1在低劑量時(shí)與毛囊發(fā)育正相關(guān)，在高劑量時(shí)呈現(xiàn)退行期變化[6]。全身或皮內(nèi)注射IGF1均不能促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，由此推斷IGF1的作用方式可能是自分泌或旁分泌[7]。皮膚組織特異性轉(zhuǎn)IGF1基因綿羊的凈毛量較非轉(zhuǎn)基因半同胞綿羊平均提高6%以上，直接證明了IGF1可以促進(jìn)動(dòng)物毛發(fā)的生長(zhǎng)，也證實(shí)了其自分泌或旁分泌的作用方式，轉(zhuǎn)基因綿羊除表現(xiàn)在凈毛量增加外，其他毛用指標(biāo)如毛直徑、毛髄質(zhì)性和減毛后體重等方面無(wú)顯著影響[8]，說(shuō)明IGF1對(duì)毛發(fā)性狀影響具有單一性；研究表明IGF1還可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和延長(zhǎng)毛囊生長(zhǎng)期的方式促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[9]。IGF1基因在畜禽中存在豐富的多態(tài)性，由于其影響牛羊生長(zhǎng)、繁殖及屠宰等性狀[10-12]，因此IGF1可作為綿羊毛用性狀的標(biāo)記基因輔助育種。本實(shí)驗(yàn)室前期統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明新吉細(xì)毛羊和小尾寒羊產(chǎn)毛性狀的相關(guān)測(cè)量值存在顯著差異，本次發(fā)現(xiàn)的IGF1基因在兩品種中存在SNP位點(diǎn)并表現(xiàn)出顯著種間差異，將為開(kāi)展IGF1基因輔助綿羊育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品采集

實(shí)驗(yàn)樣品包括皮膚組織樣品、外周血和血清樣品，皮膚組織和血清樣品采自9月份成年新吉細(xì)毛羊(超細(xì)型，又稱蘇博美利奴羊毛)和小尾寒羊各3只；外周血樣品來(lái)自126只新吉細(xì)毛羊、24只小尾寒羊和26只陶賽特羊，血樣的采集方法為頸靜脈負(fù)壓采集5 mL，肝素鈉抗凝，-20 ℃保存。新吉細(xì)毛羊群體及毛用性狀數(shù)據(jù)指標(biāo)與文獻(xiàn)相同[13]。

1.2 主要試劑及儀器

綿羊IGF1激素ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自CUSABIO公司；血基因組DNA制備試劑盒購(gòu)自Axygen公司；RNA提取Trizol試劑來(lái)自Ivitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒及其他常規(guī)試劑盒購(gòu)自寶生物公司；高保真pfu DNA聚合酶購(gòu)自Solarbio公司；基因分型試劑盒Light cycler 480 High Resolution Melting Master購(gòu)自羅氏公司；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀為羅氏公司Light cycler 480 II。

1.3 核酸提取與制備

皮膚組織總RNA提取采用Trizol法，cDNA第一鏈合成反應(yīng)參照PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以上各步按相應(yīng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

血液樣品DNA提取參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最終稀釋成工作濃度50 ng/μL，-20℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

以綿羊IGF1基因參考序列為模板，用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)IGF1克隆、定量PCR及高分辨率熔解曲線(high resolution metling，HRM)檢測(cè)引物(表1)，委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 綿羊IGF1基因擴(kuò)增引物和HRM引物

1.5 目的片段擴(kuò)增及序列測(cè)定

RT-PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×PCR Buffer(Mg+ plus) 5.0 μL，pfu DNA聚合酶(5.0 U/μL)0.5 μL，IGF1-C 混合引物(各10 μmol/L)0.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)5.0 μL，cDNA模板(50 ng/μL)1.0 μL，ddH2O 38 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、特異性片段膠回收、連接pMD-18T載體和轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，最后挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR鑒定后送生物公司測(cè)序。

1.6 IGF1基因在新吉細(xì)毛羊與小尾寒羊血清和皮膚組織中的表達(dá)

兩品種羊血清IGF1含量采用ELISA方法檢測(cè)，具體參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；皮膚組織IGF1基因表達(dá)采用qRT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green I master 10 μL，F(xiàn)/R引物(各10 mol/μL)各0.2 μL，cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，ddH2O 8.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性15 s，62 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。以上指標(biāo)兩個(gè)品種分別檢測(cè)3個(gè)個(gè)體，每個(gè)體進(jìn)行3次重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)結(jié)果利用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪制柱形圖，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 IGF1基因在三個(gè)群體中的多態(tài)性分析

采用HRM方法對(duì)新吉細(xì)毛羊、小尾寒羊和陶賽特羊三種群體的IGF1基因進(jìn)行多態(tài)性分析。HRM反應(yīng)為20 μL體系：High Resolution Melting Master 10 μL，MgCl2(2.5 mmol/L)2 μL，F(xiàn)/R引物(各10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA(50 ng/μL)1 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序如：首先95 ℃預(yù)變性10 min；隨后擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，包括變性94 ℃ 15 s，退火延伸62 ℃ 30 s；擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行HRM分型，條件為95 ℃變性1 min，40 ℃完全退火1 min，65 ℃保持1 s；從65 ℃開(kāi)始持續(xù)升溫至95 ℃并按25次/s的速率收集熒光信號(hào)；最后40 ℃冷卻1 min。利用Gene Scanning軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.8 新吉細(xì)毛羊IGF1基因多態(tài)性與毛用性狀關(guān)聯(lián)分析

收集126只新吉細(xì)毛羊的多種毛用性狀和IGF1基因型數(shù)據(jù)，利用IBM SPSS 22軟件及one-way ANOVA方法檢驗(yàn)IGF1不同基因型和毛用性狀的相關(guān)性，并以p< 0.05作為判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 綿羊IGF1基因克隆與多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)

新吉細(xì)毛羊皮膚組織cDNA的RT-PCR結(jié)果顯示目的片段稍大于500 bp(圖1)，進(jìn)一步膠回收克隆測(cè)序證實(shí)該目的片段為綿羊IGF1基因的編碼區(qū)序列，長(zhǎng)度為510 bp，由此證明IGF1基因在綿羊皮膚組織中表達(dá)。進(jìn)一步序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)sIGF1-3克隆在c.110和c.153存在SNP位點(diǎn)，分別為C>T和T>C，其中c.110位C>T導(dǎo)致a.37位(位于1-49位氨基酸蛋白信號(hào)肽區(qū)域)Ala > Val突變，Ala和Val在極性和疏水性等方面完全一致；c.153位T>C未引起氨基酸序列改變(圖2)。

圖1 綿羊IGF1基因cDNA產(chǎn)物RT-PCR擴(kuò)增

圖2 綿羊IGF1基因CDs區(qū)SNP位點(diǎn)鑒定

2.2 IGF1基因在兩種羊外周血及皮膚組織中的表達(dá)比較

分別檢測(cè)新吉細(xì)毛羊和小尾寒羊(各3只)外周血和皮膚組織的IGF1基因相對(duì)表達(dá)含量，ELISA結(jié)果顯示新吉細(xì)毛羊外周血IGF1含量約為125 ng/mL，略高于小尾寒羊的100 ng/mL(圖3(a))，差異不顯著；qRT-PCR結(jié)果顯示新吉細(xì)毛羊皮膚組織的IGF1相對(duì)表達(dá)量略高于小尾寒羊，差異倍數(shù)在0.3左右,如(圖3(b))，差異不顯著。

圖3 新吉細(xì)毛羊和小尾寒羊血清及皮膚組織IGF1表達(dá)比較

2.3 不同品種綿羊IGF1基因多態(tài)性分析

針對(duì)IGF1序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)的2個(gè)SNP位點(diǎn)，采用HRM法對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并統(tǒng)計(jì)IGF1在新吉細(xì)毛羊、小尾寒羊和陶賽特綿羊中的多態(tài)性。PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)熔解曲線標(biāo)準(zhǔn)化，如圖4(a)和平移處理圖4(b)后得到標(biāo)準(zhǔn)化溫度平移差異圖,如圖4(c)，即HRM最終分析結(jié)果。圖中看出IGF1相同基因型聚合，不同基因型區(qū)分明顯，說(shuō)明HRM方法能夠準(zhǔn)確區(qū)分綿羊IGF1基因型。各基因型PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示其中有效的SNP位點(diǎn)為c.153T>C，共有TT、TC、CC三種基因型，如圖4(c)，c.110C>T可能為稀有突變或RT-PCR實(shí)驗(yàn)中引入的人為突變，如圖4(d)。

注：(a)：標(biāo)準(zhǔn)化溶解曲線；(b)：標(biāo)準(zhǔn)化平移溶解曲線；(c)：標(biāo)準(zhǔn)化溫度平移差異圖；(d)：不同基因型測(cè)序峰圖.圖4 綿羊IGF1多態(tài)性HRM分析結(jié)果

c.153T>CSNP位點(diǎn)在小尾寒羊群體中TT基因型頻率4.17%，CC基因型頻率50.00%，TC基因型頻率45.83%；陶賽特羊群體中TT基因型頻率11.54%，CC基因型頻率50%，TC基因型頻率38.46%；新吉細(xì)毛羊群體中TT基因型頻率1.59%，CC基因型頻率30.16%，TC基因型頻率68.25%；TT基因型頻率在三個(gè)品種中最低，新吉細(xì)毛羊1.59%，小尾寒羊4.17%，陶賽特羊11.54%(表2)；CC基因型頻率在小尾寒羊和陶賽特羊中相同，均為50.00%，而新吉細(xì)毛羊只有30.16%；TC基因型頻率在新吉細(xì)毛羊中最高，達(dá)到68.25%，直接導(dǎo)致該品種T等位基因頻率最高，達(dá)到35.71%(表2)。該位點(diǎn)Hardy-weinberg平衡檢測(cè)顯示陶賽特羊和小尾寒羊χ2和p較接近，且p值大于0.05，表明兩品種該位點(diǎn)處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)，未受到選擇壓力；新吉細(xì)毛羊χ2值為29.81，p值4.67E-08，遠(yuǎn)小于0.001，表明該位點(diǎn)處于Hardy-weinberg不平衡狀態(tài)，受到極強(qiáng)的選擇壓力。

表2 不同品種綿羊IGF1基因型頻率分析

2.4 新吉細(xì)毛羊IGF1基因多態(tài)性與毛用性狀關(guān)聯(lián)分析

采用單因素方差分析方法對(duì)新吉細(xì)毛羊IGF1基因與個(gè)體羊毛的拉伸長(zhǎng)度等毛用性狀進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在拉伸長(zhǎng)度和剪毛量指標(biāo)方面TT基因型個(gè)體均高于CC基因型和TC基因型個(gè)體，并與CC基因型差異顯著(p<0.05)(表3)；在纖維直徑指標(biāo)方面TT基因型個(gè)體具有更大的纖維直徑，但各基因型間差異不顯著(表3)。

3 討論

被毛是皮膚衍生而成的特殊器官，包括毛干和毛根兩部分。毛干由死亡的角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，毛根位于皮膚并伸入毛囊內(nèi)，完整的毛囊組織包含汗腺、皮脂腺和立毛肌等附屬器官[14]。綿羊毛用性狀育種中，皮膚單位面積毛囊密度和毛囊群中次級(jí)毛囊與初級(jí)毛囊數(shù)量比值(S/P)是兩個(gè)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，除上述兩個(gè)指標(biāo)外，毛長(zhǎng)也是毛用品種的選育目標(biāo)[15]。毛囊作為毛發(fā)的發(fā)生器官，它的生理狀態(tài)決定了毛發(fā)的生長(zhǎng)狀態(tài)，有研究發(fā)現(xiàn)毛囊組織可表達(dá)多種保持自身狀態(tài)和促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的細(xì)胞因子[16]，本次檢測(cè)到綿羊皮膚組織IGF1基因并發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)SNP位點(diǎn)，為進(jìn)一步分析IGF1基因功能與毛用性狀的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

研究表明IGF1基因存在復(fù)雜的可變剪切(Alternative splicing，AS)方式[17]。研究表明在絨山羊皮膚組織中存在IGF1可變剪切異構(gòu)體[18]，但本次綿羊皮膚組織IGF1擴(kuò)增條帶特異，并未發(fā)現(xiàn)可變剪切現(xiàn)象(圖1)，推測(cè)綿羊和絨山羊皮膚組織IGF1的表達(dá)模式可能存在差異。絨山羊皮膚組織IGF1基因可變剪切影響蛋白信號(hào)肽區(qū)[18]，本研究獲得的IGF1基因編碼區(qū)的2個(gè)SNP位點(diǎn)，其中一個(gè)引起信號(hào)肽區(qū)氨基酸改變Ala37Val，但兩個(gè)氨基酸具有相似的物理性能，目前尚不明確該改變對(duì)IGF1表達(dá)分泌或功能的影響，一方面說(shuō)明IGF1功能區(qū)受到選擇壓力較大，同時(shí)也說(shuō)明綿羊和絨山羊可能采取相似的方式調(diào)節(jié)IGF1基因的表達(dá)。新吉細(xì)毛羊血清和皮膚組織IGF1表達(dá)水平均高于小尾寒羊，但差異不顯著(圖3)，IGF1基因在綿羊毛用性狀控制中可能不是關(guān)鍵因素。同時(shí)本研究個(gè)體數(shù)量較少(各3只)，未能按基因型分組，因此尚不能確定品種和基因型對(duì)IGF1基因表達(dá)的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，采用HRM方法檢驗(yàn)SNP并進(jìn)行分型，結(jié)果表明HRM方法能有效區(qū)分不同基因型信號(hào),如圖4(c)，結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序可簡(jiǎn)便鑒定出不同基因型具體突變,如圖4(d)。值得注意是，CDs序列分析得到2個(gè)SNP位點(diǎn)(圖2)，群體HRM僅鑒別到一個(gè)SNP位點(diǎn)圖4(d)，c.110C>T位點(diǎn)可能是RT-PCR反應(yīng)導(dǎo)入的人為突變或RNA編輯引起的突變。三品種IGF1基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)陶賽特羊和小尾寒羊均表現(xiàn)TT純合型最低，CC純合型最高，新吉細(xì)毛羊則表現(xiàn)TT純合型最低，TC基因型頻率最高，由此導(dǎo)致T等位基因頻率在三個(gè)群體中最高，該結(jié)果可能是品種選育過(guò)程中人為選擇壓力造成的，最直接的證據(jù)就是該位點(diǎn)卡方檢驗(yàn)處于Hardy-weinberg極度不平衡狀態(tài)(表2)。新吉細(xì)毛羊群體中IGF1基因型與毛用性狀關(guān)聯(lián)分析也表明T等位基因?qū)γ眯誀罹哂懈纳谱饔?表3)，但新吉細(xì)毛羊在如此巨大人工選擇壓力下TT純合型比例很低同樣值得深究。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了綿羊IGF1基因，在群體檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)SNP位點(diǎn)c.153T>C，分為T(mén)T、TC、CC三種基因型，三個(gè)群體間該位點(diǎn)基因型頻率卡方檢驗(yàn)均處于Hardy-weinberg不平衡狀態(tài)。新吉細(xì)毛羊群體中不同基因型個(gè)體在拉伸長(zhǎng)度和剪毛量指標(biāo)方面存在明顯差異。綿羊IGF1基因多態(tài)位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與鑒定為綿羊毛用性狀標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。