羅新惠，張立春，劉艷光,2，柳儉強，翟 博，曹 陽，張明新，金海國

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物生物技術(shù)研究所，吉林 公主嶺 136100；2.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉130021)

胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)具有促進細胞增殖、分化以及調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝等多種生理功能[1]，參與了畜禽的生長發(fā)育、繁殖及產(chǎn)奶等多種表型構(gòu)成[2-4]，在動物毛囊發(fā)育及毛發(fā)生長中也起到重要作用。研究表明IGF1在綿羊、鼠和人等多種哺乳動物及禽類的皮膚和毛囊中均有表達并有助于毛干的伸長[5]。毛囊的體外培養(yǎng)實驗也證實IGF1在低劑量時與毛囊發(fā)育正相關(guān)，在高劑量時呈現(xiàn)退行期變化[6]。全身或皮內(nèi)注射IGF1均不能促進毛發(fā)生長，由此推斷IGF1的作用方式可能是自分泌或旁分泌[7]。皮膚組織特異性轉(zhuǎn)IGF1基因綿羊的凈毛量較非轉(zhuǎn)基因半同胞綿羊平均提高6%以上，直接證明了IGF1可以促進動物毛發(fā)的生長，也證實了其自分泌或旁分泌的作用方式，轉(zhuǎn)基因綿羊除表現(xiàn)在凈毛量增加外，其他毛用指標如毛直徑、毛髄質(zhì)性和減毛后體重等方面無顯著影響[8]，說明IGF1對毛發(fā)性狀影響具有單一性；研究表明IGF1還可以通過抑制細胞凋亡和延長毛囊生長期的方式促進毛發(fā)生長[9]。IGF1基因在畜禽中存在豐富的多態(tài)性，由于其影響牛羊生長、繁殖及屠宰等性狀[10-12]，因此IGF1可作為綿羊毛用性狀的標記基因輔助育種。本實驗室前期統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明新吉細毛羊和小尾寒羊產(chǎn)毛性狀的相關(guān)測量值存在顯著差異，本次發(fā)現(xiàn)的IGF1基因在兩品種中存在SNP位點并表現(xiàn)出顯著種間差異，將為開展IGF1基因輔助綿羊育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品采集

實驗樣品包括皮膚組織樣品、外周血和血清樣品，皮膚組織和血清樣品采自9月份成年新吉細毛羊(超細型，又稱蘇博美利奴羊毛)和小尾寒羊各3只；外周血樣品來自126只新吉細毛羊、24只小尾寒羊和26只陶賽特羊，血樣的采集方法為頸靜脈負壓采集5 mL，肝素鈉抗凝，-20 ℃保存。新吉細毛羊群體及毛用性狀數(shù)據(jù)指標與文獻相同[13]。

1.2 主要試劑及儀器

綿羊IGF1激素ELISA檢測試劑盒購自CUSABIO公司；血基因組DNA制備試劑盒購自Axygen公司；RNA提取Trizol試劑來自Ivitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒及其他常規(guī)試劑盒購自寶生物公司；高保真pfu DNA聚合酶購自Solarbio公司；基因分型試劑盒Light cycler 480 High Resolution Melting Master購自羅氏公司；實時熒光定量 PCR儀為羅氏公司Light cycler 480 II。

1.3 核酸提取與制備

皮膚組織總RNA提取采用Trizol法，cDNA第一鏈合成反應(yīng)參照PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以上各步按相應(yīng)說明書進行。

血液樣品DNA提取參照試劑盒說明書進行，最終稀釋成工作濃度50 ng/μL，-20℃保存。

1.4 引物設(shè)計與合成

以綿羊IGF1基因參考序列為模板，用Oligo7.0軟件設(shè)計IGF1克隆、定量PCR及高分辨率熔解曲線(high resolution metling，HRM)檢測引物(表1)，委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 綿羊IGF1基因擴增引物和HRM引物

1.5 目的片段擴增及序列測定

RT-PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×PCR Buffer(Mg+ plus) 5.0 μL，pfu DNA聚合酶(5.0 U/μL)0.5 μL，IGF1-C 混合引物(各10 μmol/L)0.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)5.0 μL，cDNA模板(50 ng/μL)1.0 μL，ddH2O 38 μL。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共計35個循環(huán)，循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測、特異性片段膠回收、連接pMD-18T載體和轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，最后挑取陽性克隆經(jīng)菌落PCR鑒定后送生物公司測序。

1.6 IGF1基因在新吉細毛羊與小尾寒羊血清和皮膚組織中的表達

兩品種羊血清IGF1含量采用ELISA方法檢測，具體參照說明書進行；皮膚組織IGF1基因表達采用qRT-PCR檢測，反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green I master 10 μL，F(xiàn)/R引物(各10 mol/μL)各0.2 μL，cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，ddH2O 8.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性15 s，62 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。擴增反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析。以上指標兩個品種分別檢測3個個體，每個體進行3次重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參，檢測結(jié)果利用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析并繪制柱形圖，用獨立樣本t檢驗方法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.7 IGF1基因在三個群體中的多態(tài)性分析

采用HRM方法對新吉細毛羊、小尾寒羊和陶賽特羊三種群體的IGF1基因進行多態(tài)性分析。HRM反應(yīng)為20 μL體系：High Resolution Melting Master 10 μL，MgCl2(2.5 mmol/L)2 μL，F(xiàn)/R引物(各10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA(50 ng/μL)1 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序如：首先95 ℃預(yù)變性10 min；隨后擴增45個循環(huán)，包括變性94 ℃ 15 s，退火延伸62 ℃ 30 s；擴增結(jié)束后進行HRM分型，條件為95 ℃變性1 min，40 ℃完全退火1 min，65 ℃保持1 s；從65 ℃開始持續(xù)升溫至95 ℃并按25次/s的速率收集熒光信號；最后40 ℃冷卻1 min。利用Gene Scanning軟件進行結(jié)果分析。

1.8 新吉細毛羊IGF1基因多態(tài)性與毛用性狀關(guān)聯(lián)分析

收集126只新吉細毛羊的多種毛用性狀和IGF1基因型數(shù)據(jù)，利用IBM SPSS 22軟件及one-way ANOVA方法檢驗IGF1不同基因型和毛用性狀的相關(guān)性，并以p< 0.05作為判定標準。

2 實驗結(jié)果

2.1 綿羊IGF1基因克隆與多態(tài)位點檢測

新吉細毛羊皮膚組織cDNA的RT-PCR結(jié)果顯示目的片段稍大于500 bp(圖1)，進一步膠回收克隆測序證實該目的片段為綿羊IGF1基因的編碼區(qū)序列，長度為510 bp，由此證明IGF1基因在綿羊皮膚組織中表達。進一步序列比對發(fā)現(xiàn)sIGF1-3克隆在c.110和c.153存在SNP位點，分別為C>T和T>C，其中c.110位C>T導(dǎo)致a.37位(位于1-49位氨基酸蛋白信號肽區(qū)域)Ala > Val突變，Ala和Val在極性和疏水性等方面完全一致；c.153位T>C未引起氨基酸序列改變(圖2)。

圖1 綿羊IGF1基因cDNA產(chǎn)物RT-PCR擴增

圖2 綿羊IGF1基因CDs區(qū)SNP位點鑒定

2.2 IGF1基因在兩種羊外周血及皮膚組織中的表達比較

分別檢測新吉細毛羊和小尾寒羊(各3只)外周血和皮膚組織的IGF1基因相對表達含量，ELISA結(jié)果顯示新吉細毛羊外周血IGF1含量約為125 ng/mL，略高于小尾寒羊的100 ng/mL(圖3(a))，差異不顯著；qRT-PCR結(jié)果顯示新吉細毛羊皮膚組織的IGF1相對表達量略高于小尾寒羊，差異倍數(shù)在0.3左右,如(圖3(b))，差異不顯著。

圖3 新吉細毛羊和小尾寒羊血清及皮膚組織IGF1表達比較

2.3 不同品種綿羊IGF1基因多態(tài)性分析

針對IGF1序列比對發(fā)現(xiàn)的2個SNP位點，采用HRM法對SNP位點進行基因分型，并統(tǒng)計IGF1在新吉細毛羊、小尾寒羊和陶賽特綿羊中的多態(tài)性。PCR擴增結(jié)果經(jīng)熔解曲線標準化，如圖4(a)和平移處理圖4(b)后得到標準化溫度平移差異圖,如圖4(c)，即HRM最終分析結(jié)果。圖中看出IGF1相同基因型聚合，不同基因型區(qū)分明顯，說明HRM方法能夠準確區(qū)分綿羊IGF1基因型。各基因型PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果顯示其中有效的SNP位點為c.153T>C，共有TT、TC、CC三種基因型，如圖4(c)，c.110C>T可能為稀有突變或RT-PCR實驗中引入的人為突變，如圖4(d)。

注：(a)：標準化溶解曲線；(b)：標準化平移溶解曲線；(c)：標準化溫度平移差異圖；(d)：不同基因型測序峰圖.圖4 綿羊IGF1多態(tài)性HRM分析結(jié)果

c.153T>CSNP位點在小尾寒羊群體中TT基因型頻率4.17%，CC基因型頻率50.00%，TC基因型頻率45.83%；陶賽特羊群體中TT基因型頻率11.54%，CC基因型頻率50%，TC基因型頻率38.46%；新吉細毛羊群體中TT基因型頻率1.59%，CC基因型頻率30.16%，TC基因型頻率68.25%；TT基因型頻率在三個品種中最低，新吉細毛羊1.59%，小尾寒羊4.17%，陶賽特羊11.54%(表2)；CC基因型頻率在小尾寒羊和陶賽特羊中相同，均為50.00%，而新吉細毛羊只有30.16%；TC基因型頻率在新吉細毛羊中最高，達到68.25%，直接導(dǎo)致該品種T等位基因頻率最高，達到35.71%(表2)。該位點Hardy-weinberg平衡檢測顯示陶賽特羊和小尾寒羊χ2和p較接近，且p值大于0.05，表明兩品種該位點處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)，未受到選擇壓力；新吉細毛羊χ2值為29.81，p值4.67E-08，遠小于0.001，表明該位點處于Hardy-weinberg不平衡狀態(tài)，受到極強的選擇壓力。

表2 不同品種綿羊IGF1基因型頻率分析

2.4 新吉細毛羊IGF1基因多態(tài)性與毛用性狀關(guān)聯(lián)分析

采用單因素方差分析方法對新吉細毛羊IGF1基因與個體羊毛的拉伸長度等毛用性狀進行了分析，結(jié)果顯示在拉伸長度和剪毛量指標方面TT基因型個體均高于CC基因型和TC基因型個體，并與CC基因型差異顯著(p<0.05)(表3)；在纖維直徑指標方面TT基因型個體具有更大的纖維直徑，但各基因型間差異不顯著(表3)。

3 討論

被毛是皮膚衍生而成的特殊器官，包括毛干和毛根兩部分。毛干由死亡的角質(zhì)細胞構(gòu)成，毛根位于皮膚并伸入毛囊內(nèi)，完整的毛囊組織包含汗腺、皮脂腺和立毛肌等附屬器官[14]。綿羊毛用性狀育種中，皮膚單位面積毛囊密度和毛囊群中次級毛囊與初級毛囊數(shù)量比值(S/P)是兩個重要的評價指標，除上述兩個指標外，毛長也是毛用品種的選育目標[15]。毛囊作為毛發(fā)的發(fā)生器官，它的生理狀態(tài)決定了毛發(fā)的生長狀態(tài)，有研究發(fā)現(xiàn)毛囊組織可表達多種保持自身狀態(tài)和促進毛發(fā)生長的細胞因子[16]，本次檢測到綿羊皮膚組織IGF1基因并發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)SNP位點，為進一步分析IGF1基因功能與毛用性狀的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

研究表明IGF1基因存在復(fù)雜的可變剪切(Alternative splicing，AS)方式[17]。研究表明在絨山羊皮膚組織中存在IGF1可變剪切異構(gòu)體[18]，但本次綿羊皮膚組織IGF1擴增條帶特異，并未發(fā)現(xiàn)可變剪切現(xiàn)象(圖1)，推測綿羊和絨山羊皮膚組織IGF1的表達模式可能存在差異。絨山羊皮膚組織IGF1基因可變剪切影響蛋白信號肽區(qū)[18]，本研究獲得的IGF1基因編碼區(qū)的2個SNP位點，其中一個引起信號肽區(qū)氨基酸改變Ala37Val，但兩個氨基酸具有相似的物理性能，目前尚不明確該改變對IGF1表達分泌或功能的影響，一方面說明IGF1功能區(qū)受到選擇壓力較大，同時也說明綿羊和絨山羊可能采取相似的方式調(diào)節(jié)IGF1基因的表達。新吉細毛羊血清和皮膚組織IGF1表達水平均高于小尾寒羊，但差異不顯著(圖3)，IGF1基因在綿羊毛用性狀控制中可能不是關(guān)鍵因素。同時本研究個體數(shù)量較少(各3只)，未能按基因型分組，因此尚不能確定品種和基因型對IGF1基因表達的影響。

本實驗通過優(yōu)化引物設(shè)計，采用HRM方法檢驗SNP并進行分型，結(jié)果表明HRM方法能有效區(qū)分不同基因型信號,如圖4(c)，結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測序可簡便鑒定出不同基因型具體突變,如圖4(d)。值得注意是，CDs序列分析得到2個SNP位點(圖2)，群體HRM僅鑒別到一個SNP位點圖4(d)，c.110C>T位點可能是RT-PCR反應(yīng)導(dǎo)入的人為突變或RNA編輯引起的突變。三品種IGF1基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)陶賽特羊和小尾寒羊均表現(xiàn)TT純合型最低，CC純合型最高，新吉細毛羊則表現(xiàn)TT純合型最低，TC基因型頻率最高，由此導(dǎo)致T等位基因頻率在三個群體中最高，該結(jié)果可能是品種選育過程中人為選擇壓力造成的，最直接的證據(jù)就是該位點卡方檢驗處于Hardy-weinberg極度不平衡狀態(tài)(表2)。新吉細毛羊群體中IGF1基因型與毛用性狀關(guān)聯(lián)分析也表明T等位基因?qū)γ眯誀罹哂懈纳谱饔?表3)，但新吉細毛羊在如此巨大人工選擇壓力下TT純合型比例很低同樣值得深究。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了綿羊IGF1基因，在群體檢測中發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)SNP位點c.153T>C，分為TT、TC、CC三種基因型，三個群體間該位點基因型頻率卡方檢驗均處于Hardy-weinberg不平衡狀態(tài)。新吉細毛羊群體中不同基因型個體在拉伸長度和剪毛量指標方面存在明顯差異。綿羊IGF1基因多態(tài)位點的發(fā)現(xiàn)與鑒定為綿羊毛用性狀標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。