楊 鵬，何 洋，李 成，王黎洲，蔣天鵬，許國輝，周 石

肝細(xì)胞肝癌（HCC）是發(fā)生在肝內(nèi)膽管或肝細(xì)胞內(nèi)惡性腫瘤主要類型，其治療方案包括手術(shù)切除、介入治療、放化療、生物治療、靶向藥物治療等［1］。目前很多研究表明諸多癌癥發(fā)生和發(fā)展與微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）在體內(nèi)表達(dá)增多有一定聯(lián)系［2］，甚至限定某種特定 miR 表達(dá)增多，可能與某種特定癌癥有著單一對(duì)象聯(lián)系［3］。其中不同miRNA又大致分為兩種，一種起類癌基因作用，另一類起抑癌基因作用［4］。有研究發(fā)現(xiàn) miR-7 在肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌中表達(dá)均有所下降，因此起到抑癌基因作用［5-6］，但具體作用機(jī)制未完全明確。表皮細(xì)胞生長因子受體（EGFR）可在大多數(shù)腫瘤中過度表達(dá)和/或突變，與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管生成密切相關(guān)［7］。近年臨床研究證實(shí)EGFR存在于許多實(shí)體瘤體中，其表達(dá)與miR-7 表達(dá)有一定關(guān)聯(lián)［8］。因此，本研究探討 miR-7 是否通過靶向調(diào)控肝癌細(xì)胞中EGFR，進(jìn)而對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，為其治療新策略提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2 人肝癌細(xì)胞株（美國菌種保藏中心ATCC）置于10%胎牛血清（FBS）并加入100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL 青霉素的Roswell Park 紀(jì)念研究所（RPMI）培養(yǎng)基，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長為80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測

在線數(shù)據(jù)庫（Http：//www.xnicroma.org/microma/home.do）查找相應(yīng)資料，確定EGFR 是否為miR-7目的基因；從Ensembl 網(wǎng)站查找EGFR 基因序列，再將找到的條件合適的基因序列復(fù)制到Primer designing tool 網(wǎng)站設(shè)計(jì)合適引物，方便為下一步聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。將HepG2 人肝癌細(xì)胞分為miR-7 上調(diào)組和miR-7 下調(diào)組，其中上調(diào)組又分為激動(dòng)劑組（mimic）、激動(dòng)劑陰性對(duì)照組（mimic negative）、空白對(duì)照組（mock）；下調(diào)組又分為抑制劑組（inhibitor）、抑制劑陰性對(duì)照組（inhibitor negative）、空白對(duì)照組（mock）。

在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種適當(dāng)數(shù)量HepG2 人肝癌細(xì)胞，密度為30%～50%。準(zhǔn)備mimic-Lipo2000混合液：稀釋制備micro RNA mimic 50 μL，稀釋制備 Lipo2000 250 μL，室溫孵育 5 min；二者混勻，室溫孵育 20 min。將混合液加入培養(yǎng)孔中，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48～72 h 后測序。進(jìn)入 Ensembl 網(wǎng)站查找miR-7 基因序列，條件合適的基因序列復(fù)制至Primer designing tool 網(wǎng)站設(shè)計(jì)合適引物。引物序列見表1。

表1 引物序列表

取 TRIzol 裂解液（美國 Invitrogen 公司），按 1∶0.2比例加入氯仿，將混合后的TRIzol 裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心管中加入事先培養(yǎng)好的肝癌細(xì)胞，37°恒溫水浴鍋孵育10 min，放入4℃離心機(jī)，10 000 r/min離心10 min。離心后取上層無色透明相，進(jìn)行RNA沉淀。將無色透明相放入新Eppendorf 管中，加入等體積異丙醇，37°恒溫水浴鍋孵育10 min，隨即放入 4℃離心機(jī)，10 000 r/min 離心10 min。棄上清，按1∶1.5 比例加入TRIzol 裂解液和75%乙醇對(duì)蛋白進(jìn)行清洗，放入4℃離心機(jī)，6 000 r/min 離心5 min。采用紫外吸收法進(jìn)行RNA 質(zhì)量檢測，讀取其在260～280 nm 處吸收值。

1.3 蛋白印跡法檢測EGFR 表達(dá)

采用放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解緩沖液（北京百泰克生物技術(shù)公司）從HepG2 人肝癌細(xì)胞分離總蛋白。采用二辛可酸（BCA）測定試劑盒（美國BioTek 公司）測定蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）（碧云天生物技術(shù)研究所）分級(jí)分離總蛋白（20 μg），轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國 Millipore 公司）。含 0.1%Tween溶液的 Tris 緩沖 0.9%NaCl 溶液（TBST）和 10%脫脂奶粉在室溫下封閉PVDF 膜1 h，阻斷非特異性位點(diǎn)。4℃下將膜與小鼠抗人EGFR 單克隆一抗（1∶1 000，ab155944）和小鼠抗人 GADPH 單克隆一抗（1∶1 000，ab9484，英國 Abcam 公司）孵育過夜。TBST 洗滌膜3 次，并與山羊抗小鼠IgG 辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗體（1∶3 000，ab6789，英國 Abcam 公司）室溫下再孵育2 h。TBST 洗滌3 次，采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光溶液（美國Thermo Fisher 科技公司）使膜可視化。

1.4 溴化噻唑藍(lán)四氮唑法實(shí)驗(yàn)

每組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，磷酸緩沖液（PBS）清洗一遍，選用胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每200 μL含 200 個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)鋪96 孔板，各組細(xì)胞鋪8 個(gè)復(fù)孔，共 4 塊 96 孔板，置于 37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè) 定 0 h、24 h、48 h、72 h 4 個(gè) 時(shí) 間點(diǎn) 。在 細(xì) 胞miRNA 或siRNA 轉(zhuǎn)染48 h 后每孔加入溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT）溶液 20 μL，37℃孵育 4 h；棄上清，每孔加 150 μL 二甲基亞砜（DMSO）溶解（美國 Sigma-Aldrich 公司） 10 min，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）讀數(shù)器（美國 BioTek 公司）檢測 490 nm 處吸光度（OD），根據(jù)OD 值計(jì)算細(xì)胞增殖率（細(xì)胞增殖率＝每天細(xì)胞MTT OD 值/0 d 細(xì)胞 MTT OD 值×100%）。

1.5 劃痕試驗(yàn)

先用記號(hào)筆做好標(biāo)志，每隔0.5 cm 畫一橫線，每孔至少穿過5 條線。HepG2 人細(xì)胞置于CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，定期更換培養(yǎng)液，37℃保溫培養(yǎng)。將細(xì)胞接種在孔板中，待其生長至表面融合時(shí)，用無菌槍頭在表層細(xì)胞上均勻劃痕，隨后用PBS 輕柔洗滌。以 0 h、24 h、48 h 為時(shí)間點(diǎn)，觀察不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞遷移情況，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料及組間和組內(nèi)比較用相關(guān)性分析檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)和等級(jí)資料分析用卡方檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

熒光定量PCR 證實(shí)，miR-7 經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后在HepG2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染成功，EGFR mRNA 表達(dá)與miR-7呈 負(fù) 相 關(guān) 。mimic 組 、mimic negative 組 、mock 組EGFR mRNA 表達(dá)量分別為 1213±0.97、0.36±0.12、0.58±0.3； mimic 組與 mimic negative 組、mock 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。inhhibitor 組、inhhibitor negative 組、mock 組 EGFR mRNA 表達(dá)量分 別 為 1.8±0.56、0.44±0.32、4.03±0.76； inhhibitor組與 inhhibitor negative 組、mock 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 EGFR 表達(dá)

蛋白印跡法觀察顯示，miR-7 表達(dá)同樣與EGFR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在上調(diào)組，EGFR 在mimic 組表達(dá)下調(diào)，mimic negative 組和 mock 組次之，在下調(diào)組，EGFR在inhibitior 組表達(dá)上調(diào)，mimic negative 組和mock組次之；mimic 組、mimic negative 組、mock 組 EGFR平均光密度值表達(dá)量分別為 0.43±0.03、0.28±0.26、0.21±0.04，mimic 組與 mimic negative 組、mock 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；inhhibitor 組、inhhibitor negative 組、mock 組 EGFR 表達(dá)量分別為 0.21±0.05、0.32±0.02、0.19±0.03，inhhibitor 組與 inhhibitor negative組、mock 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 miR-7 對(duì)肝癌細(xì)胞生長的影響

MTT 試驗(yàn)結(jié)果顯示，在高表達(dá)組，隨著miR-7表達(dá)上調(diào)，肝癌細(xì)胞增殖速度明顯減慢；在低表達(dá)組，隨著miR-7 表達(dá)下調(diào)，肝癌細(xì)胞增殖速度明顯增快，見表2、圖3。

2.4 miR-7 對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲速度的影響

劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，在高表達(dá)組，mock 組劃痕速度最快，隨后依次為mimic negative 組、mimic 組；在低表達(dá)組，inhibitior 組劃痕速度最快，隨后依次為inhibitior negative 組、mock 組，見圖4。

3 討論

肝癌具體發(fā)病機(jī)制有諸多可能，目前認(rèn)為最基本發(fā)病機(jī)制當(dāng)屬原癌基因與抑癌基因關(guān)系失衡［9-11］。有研究證實(shí)miRNA 與原發(fā)性肝癌發(fā)展有著十分密切聯(lián)系［12］。EGFR、 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR）、肝細(xì)胞生長因子受體、成纖維細(xì)胞生長因子受體等，尤其是VEGFR，是目前公認(rèn)的最有效的肝癌靶向藥物［13］?；谝陨涎芯?，本研究選擇EGFR作為目的基因，通過相關(guān)調(diào)節(jié)因素miRNA，觀察是否能控制EGFR 表達(dá)，進(jìn)而從側(cè)面印證EGFR 可能作為肝癌治療的一有意義靶點(diǎn)。

圖1 EGFR mRNA 在上調(diào)各組和下調(diào)各組轉(zhuǎn)染情況

圖2 EGFR 在miR-7 中表達(dá)和蛋白印跡檢測結(jié)果

表2 不同組間肝癌細(xì)胞增殖速度 ±s

表2 不同組間肝癌細(xì)胞增殖速度 ±s

**與 mimic 組相比，P＜0.01； △△與 inhibitor 組相比，P＜0.01

24 h 48 h 72 h組別 0 h高表達(dá)組mimic 0.145±0.376 0.180±0.342 0.227±0.384 0.434±0.394 mimic negative 0.133±0.235** 0.207±0.784** 0.267±0.483** 0.665±0.482**mock 0.135±0.456** 0.208±0.383** 0.302±0.732** 0.665±0.722**低表達(dá)組inhibitor 0.243±0.566 0.277±0.382 0.604±0.783 0.845±0.345 inhibitor negative 0.184±0.320△△ 0.204±0.872△△ 0.306±0.982△△ 0.628±0.837△△mock 0.154±0.273△△ 0.187±0.823△△ 0.233±0.739△△ 0.526±0.642△△

圖3 肝癌細(xì)胞在不同組間增殖速度

圖4 肝癌細(xì)胞在不同組中的侵襲速度

miRNA 家族中miR-7，主要充當(dāng)抑癌基因的作用。有研究顯示，其具有控制腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移及抑制細(xì)胞分化的作用［14］。miR-7 同時(shí)還與體內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，通過參與不同通路過程對(duì)體內(nèi)不同生物活動(dòng)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)［15］。miR-7 可在包括肝癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)瘤、腸癌等多種腫瘤發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用［15］。有研究顯示，miR-7 可通過抑制EGFR 表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷徙［16］。本研究發(fā)現(xiàn) miR-7 在 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，熒光定量PCR 檢測顯示EGFR mRNA 表達(dá)量與miR-7 呈負(fù)相關(guān)，蛋白印跡檢測也證實(shí) miR-7 表達(dá)與 EGFR 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明EGFR 極有可能是原發(fā)性肝癌的關(guān)鍵基因之一；與之前報(bào)道［16］不同的是，驗(yàn)證了miR-7 同樣可通過調(diào)控EGFR 抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移。

近期有研究發(fā)現(xiàn)miR-7 可改變黏著斑激酶磷酸化及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，從而介導(dǎo)肝癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移［17］。本研究通過 MTT 試驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-7 高表達(dá)mimic 組中肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移速度明顯低于陰性和空白對(duì)照組，miR-7 低表達(dá)inhhibitor 組中肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移速度明顯高于陰性和空白對(duì)照組；表明肝癌細(xì)胞中EGFR 表達(dá)對(duì)于細(xì)胞增殖和遷徙均有一定的調(diào)控作用，且受到內(nèi)源性miR-7 影響。

本研究結(jié)論認(rèn)為，miR-7 可通過直接靶向調(diào)節(jié)EGFR 蛋白表達(dá)，進(jìn)而對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生負(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)影響，可能是未來肝癌治療新策略的潛在靶點(diǎn)。