李 進 雷 斌 翟夢華 王 莉 張軍高 周小云 梁 晶

(新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術生物技術研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室/新疆維吾爾自治區(qū)原子能農(nóng)學會,新疆 烏魯木齊 830091)

棉花(GossypiumhirsutumL.)是新疆維吾爾自治區(qū)(以下簡稱“新疆”)重要的經(jīng)濟作物,也是特色優(yōu)勢作物,2019年種植面積為254.05萬hm2,總產(chǎn)為500.20萬t,分別占全國棉花種植面積和總產(chǎn)的76.0%和84.9%,在中國棉花產(chǎn)業(yè)和農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位[1]。新疆棉花規(guī)?；l(fā)展面臨著諸多挑戰(zhàn),尤其是苗期低溫冷害和“倒春寒”造成的死苗問題亟待解決[2-4]。因此,探明棉花苗期對低溫脅迫響應的生理生化機制,尋求抵御棉花苗期低溫危害的技術手段,已成為現(xiàn)階段新疆棉花高效輕簡化栽培研究中不可或缺的部分,對促進新疆棉花產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量持續(xù)健康發(fā)展具有重要的理論和實踐意義。

低溫脅迫會誘導植物產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),從而引起膜脂過氧化程度增加,造成膜系統(tǒng)損傷,導致植物生理生化代謝紊亂,并嚴重抑制植物生長發(fā)育[5-7]?？箟难?谷胱甘肽(ascorbate-glutathione,AsA-GSH)循環(huán)是植物體內(nèi)清除ROS的重要途徑,其中還原型抗壞血酸(reduced ascorbic acid,AsA)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)是AsA-GSH循環(huán)中重要的抗氧化物質(zhì),既可以直接還原ROS,又可以作為酶底物清除ROS[8]?？箟难徇^氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)是AsA-GSH循環(huán)的主要酶系組分,它們與AsA和GSH共同參與植物細胞中抗氧化物質(zhì)再生和ROS清除[8-10]。已有研究表明,玉米[11]、甘藍[12]、番茄[13]、黃瓜[14]和杏[15]等可通過調(diào)控AsA-GSH循環(huán)中抗氧化非酶物質(zhì)含量和抗氧化酶活性來減輕氧化應激損傷,維持植株幼苗體內(nèi)的氧化還原平衡。

近年來前人圍繞低溫脅迫開展了棉花幼苗生長特性[16-17]、光合熒光特性[17-18]、酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等生理特性[19-21]及基因表達[22-23]方面的研究,但有關棉花幼苗AsA-GSH循環(huán)對低溫脅迫的響應機制研究較少,同時對根、莖和葉生理代謝的研究更是鮮見。基于此,本研究以新陸早57號為試驗材料,通過室內(nèi)模擬低溫試驗,探討4℃低溫脅迫下棉花幼苗根、莖和葉AsA-GSH循環(huán)中抗氧化物質(zhì)含量、氧化還原狀態(tài)和抗氧化酶活性的變化規(guī)律,揭示棉花幼苗營養(yǎng)器官對低溫脅迫的響應機制,旨在為豐富棉花耐低溫機理和高產(chǎn)栽培理論提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試棉花品種為新陸早57號,由新疆農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所提供;供試基質(zhì)為丹麥品氏基質(zhì)(PINDSTRUP),購于新疆明珠花卉市場。

1.2 試驗設計

試驗于2019年2月至10月在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室(烏魯木齊)進行。挑選籽粒飽滿的棉花種子,75%酒精浸泡2～3 min,無菌水沖洗2～3次備用。將棉種播于裝滿基質(zhì)的育苗營養(yǎng)缽(下底直徑×上口直徑×高度:6 cm×8.5 cm×10 cm)中,每缽9粒種子,共計48缽。置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照強度:50μmol·m-2·s-1,晝/夜:14 h/10 h,溫度:28℃/22℃,相對濕度:70%～75%),子葉展平時每缽定苗5株,每天補充適量蒸餾水,長至2葉期舍棄長勢較差且不整齊的營養(yǎng)缽,篩選長勢較好且整齊一致的幼苗進行4℃/4℃(晝/夜)低溫處理,分別在處理0(28℃/22℃)、1(4℃/4℃)和2 d(4℃/4℃)時采集棉花幼苗根、莖和第2片真葉,每個處理重復3次,迅速清洗干凈,經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱中用于生理指標測定。試驗期間每個處理其他環(huán)境條件及管理措施均一致。

1.3 測定項目與方法

分別準確稱取0.1 g各處理根、莖和葉,采用各指標試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)提取組織樣品的上清液,置于冰盒內(nèi)待測[24]。

1.3.1 AsA含量測定 按照AsA測定試劑盒(貨號:AsA-1-W)說明書配制空白管和測定管待測液,靜置20 min后吸取200μL加入96孔板中,采用SpectraMax?i3x多功能酶標儀(美谷分子儀器有限公司,奧地利)在420 nm波長處測定吸光度值A測和A空。根據(jù)公式計算AsA含量:

式中,W為樣本質(zhì)量,g。下同。

1.3.2 氧化型抗壞血酸(dehydroascorbate,DHA)含量測定 按照DHA測定試劑盒(貨號:DHA-1-W)說明書配制空白管和測定管待測液,迅速混勻后在265 nm波長處測定反應10和130 s時的吸光度值A空1、A空2和A測1、A測2。根據(jù)公式計算DHA含量:

1.3.3 GSH含量測定 按照GSH測定試劑盒(貨號:GSH-1-W)說明書配制空白管和測定管待測液。混勻靜置2 min后于412 nm波長處測定吸光度值A空和A測。根據(jù)公式計算GSH含量:

1.3.4 GSSG含量測定 按照氧化型合胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)測定試劑盒(貨號:GSSG-1-W)說明書配制待測混合液。于96孔板迅速混勻后于412 nm波長處測定反應30和150 s時的吸光度值A1和A2。根據(jù)公式計算GSSG含量:

1.3.5 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定 按照蛋白質(zhì)(protein concentration,Cpr)測定試劑盒(貨號:BCAP-1-W)說明書配制空白管、標準管和測定管待測液,60℃保溫30 min后加入96孔板于562 nm波長處測定吸光度值,分別記為A空、A標和A測。根據(jù)公式計算Cpr濃度:

1.3.6 APX活性測定 按照APX測定試劑盒(貨號:APX-1-W)說明書配制待測液,迅速混勻后于290 nm波長處測定反應10和130 s時的吸光度值A1和A2。根據(jù)公式計算APX活性:

式中,Cpr為上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg·mL-1。下同。

1.3.7 MDHAR活性測定 按照MDHAR測定試劑盒(貨號:MDHAR-1-W)說明書配制待測液,迅速混勻后于340 nm波長處測定反應30和150 s時的吸光度值A1和A2。根據(jù)公式計算MDHAR活性:

1.3.8 DHAR活性測定 按照DHAR測定試劑盒(貨號:DHAR-1-W)說明書配制待測液,迅速混勻后于265 nm波長處測定反應30和150 s時的吸光度值A1和A2。根據(jù)公式計算DHAR活性:

1.3.9 GPX活性測定 按照GPX測定試劑盒(貨號:GPX-1-W)說明書配制空白管和測定管待測液,迅速混勻后于340 nm波長處測定反應10和190 s時的吸光度值A空1、A空2和A測1、A測2。根據(jù)公式計算GPX活性:

1.3.10 GR活性測定 按照GR測定試劑盒(貨號:GR-1-W)說明書配制空白管和測定管待測液,迅速混勻后于340 nm波長處測定反應10和190 s時的吸光度值A空1、A空2和A測1、A測2。根據(jù)公式計算GR活性:

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)計算,采用GraphPad Prism 7.0繪圖,采用SPSS Statistics 25.0進行方差分析(P＜0.05),并采用Duncan氏法進行多重比較檢驗。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對棉花幼苗營養(yǎng)器官內(nèi)抗壞血酸含量及代謝酶活性的影響

2.1.1 AsA、DHA含量及AsA/DHA比率的變化 由圖1-A可知,棉花幼苗根、莖和葉中AsA含量均隨著低溫脅迫時間的延長呈上升趨勢。與0 d相比,棉花幼苗根中AsA含量在低溫脅迫1 d時無顯著差異,至低溫脅迫2 d時顯著增加,較0 d增加14.13%;棉花幼苗莖和葉中AsA含量在低溫脅迫1 d時均顯著增加,且低溫脅迫2 d時AsA含量顯著高于低溫脅迫1 d,其中與0 d相比,低溫脅迫1和2 d莖中AsA含量分別增加33.33%和110.56%,葉中AsA含量則分別增加56.75%和128.53%。棉花幼苗根中AsA含量整體低于莖和葉。說明棉花幼苗根、莖和葉可通過產(chǎn)生較多的AsA來清除組織中過多的ROS,以減輕低溫對棉花幼苗造成的傷害。

由圖1-B可知,與0 d相比,棉花幼苗根中DHA含量在低溫脅迫1 d時顯著降低,但低溫脅迫2 d時顯著增加,較0 d增加16.00%;棉花幼苗莖中DHA含量在低溫脅迫過程中呈先下降后上升的趨勢,且低溫脅迫2 d時DHA含量較低溫脅迫1 d時顯著增加,但均低于低溫脅迫0 d時的DHA含量,分別低35.34%和12.93%;棉花幼苗葉中DHA含量在低溫脅迫1 d時無顯著差異,低溫脅迫2 d時顯著增加,較0 d增加51.31%。棉花幼苗葉中DHA含量明顯高于根和莖。

由圖1-C可知,與0 d相比,棉花幼苗根中抗壞血酸氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA比率)在低溫脅迫過程中表現(xiàn)為先升高后下降,但均與0 d無顯著差異;棉花幼苗莖中AsA/DHA比率在低溫脅迫過程中顯著升高,低溫脅迫1和2 d時分別較0 d增加105.47%和141.80%;棉花幼苗葉中AsA/DHA比率在低溫脅迫1和2 d時均顯著增加,但低溫脅迫2 d時與低溫脅迫1 d時無顯著差異。低溫脅迫顯著增加了棉花幼苗莖和葉中AsA/DHA比率,根中AsA/DHA比率變化幅度較小且最終降低。說明低溫脅迫可通過增加莖和葉中AsA/DHA比率來抵御低溫脅迫,葉片氧化還原狀態(tài)最強烈,且低溫脅迫對棉花幼苗根影響較大。

2.1.2 APX、MDHAR和DHAR活性的變化 由圖2-A可知,隨著低溫脅迫時間的延長,棉花幼苗根中APX活性總體呈下降趨勢,而莖和葉中APX活性呈上升趨勢。與0 d相比,低溫脅迫1和2 d時棉花幼苗根中APX活性分別降低16.77%和9.98%,而莖和葉中APX活性分別提高1.61%和11.25%(莖)、3.61%和13.06%(葉)。說明棉花幼苗莖和葉可以通過提高APX活性來清除ROS,從而減輕低溫脅迫對其造成的傷害,低溫脅迫對棉花幼苗根的傷害程度大于莖和葉。

由圖2-B可知,隨著低溫脅迫時間的延長,棉花幼苗根、莖和葉中MDHAR活性均呈上升趨勢,與0 d相比,低溫脅迫1和2 d時分別提高49.68%和88.37%(根)、16.78%和45.67%(莖)、44.78%和59.72%(葉)。說明棉花幼苗根、莖和葉可通過提高MDHAR活性來催化產(chǎn)生AsA,增加ROS清除能力,以減輕低溫對棉花幼苗的傷害。

由圖2-C可知,與0 d相比,低溫脅迫1 d時棉花幼苗根和葉中DHAR活性顯著升高,分別增加12.09%和13.76%,低溫脅迫2 d時均與0 d無顯著差異;隨著低溫脅迫時間的延長棉花幼苗莖中DHAR活性逐漸升高,低溫脅迫1和2 d時分別較0 d提高13.93%和21.50%。說明棉花幼苗根、莖和葉可通過調(diào)控DHAR活性,使AsA和GSH含量維持在較高水平以適應低溫脅迫。

2.2 低溫脅迫對棉花幼苗營養(yǎng)器官內(nèi)谷胱甘肽含量及代謝酶活性的影響

2.2.1 GSH、GSSG含量及GSH/GSSG比率的變化由圖3-A可知,隨著低溫脅迫時間的延長,低溫脅迫1和2 d時棉花幼苗根中GSH含量分別較0 d降低14.12%和9.68%,但差異不顯著;棉花幼苗莖和葉中GSH含量則呈上升趨勢,其中低溫脅迫1和2 d時葉中GSH含量分別較0 d顯著增加6.08%和16.60%,低溫脅迫2 d時莖中GSH含量較0 d顯著增加28.96%。綜上,低溫脅迫減少了棉花幼苗根中GSH含量,增加了莖和葉中GSH含量,且葉中GSH含量整體高于根和莖。說明棉花幼苗莖和葉可通過增加GSH含量來保持細胞膜的穩(wěn)定性,以減輕低溫對棉花幼苗造成的傷害。

由圖3-B可知,與0 d相比,棉花幼苗根中GSSG含量在低溫脅迫1和2 d時分別增加33.79%和15.93%,且低溫脅迫1 d時與0 d差異達顯著水平;棉花幼苗莖中GSSG含量則隨著低溫脅迫時間的延長呈先降低后升高的趨勢,其中,低溫脅迫1 d時較0 d顯著降低11.81%,低溫脅迫2 d時較0 d顯著增加10.32%;隨著低溫脅迫時間的延長,棉花幼苗葉中GSSG含量無顯著差異?？傮w而言,低溫脅迫增加了根和莖中GSSG含量,且莖中GSSG含量整體高于根和葉。說明低溫脅迫對棉花幼苗根、莖和葉產(chǎn)生不同程度影響,低溫脅迫對葉的傷害程度小于根和莖。

由圖3-C可知,與0 d相比,低溫脅迫1和2 d時棉花幼苗根中谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)(GSH/GSSG比率)顯著下降,分別降低35.53%和21.75%;棉花幼苗莖中GSH/GSSG比率在低溫脅迫過程中無顯著差異;棉花幼苗葉中GSH/GSSG比率在低溫脅迫1 d時無顯著差異,但在低溫脅迫2 d時顯著增加17.50%?？傮w而言,低溫脅迫降低了根中GSH/GSSG比率,增加了葉中GSH/GSSG比率,對莖中GSH/GSSG比率無明顯影響,進一步說明低溫脅迫主要對棉花幼苗根造成傷害,對棉花幼苗莖影響較小,推測棉花幼苗葉可通過誘導和調(diào)控DHAR、GPX及GR活性來維持GSH含量在較高水平。

2.2.2 GPX和GR活性的變化 由圖4-A可知,隨著低溫脅迫時間的延長,棉花幼苗根、莖和葉中GPX活性無顯著差異,但低溫脅迫2 d分別較0 d提高2.58%、3.99%和7.53%。說明棉花幼苗營養(yǎng)器官GPX活性始終在正常水平狀態(tài)下催化GSH與ROS反應,但抑制GPX活性持續(xù)升高以減少GSH消耗,從而維持GSH庫,保持細胞膜的穩(wěn)定性。

由圖4-B可知,與0 d相比,低溫脅迫1和2 d時棉花幼苗根、莖和葉中的GR活性均顯著升高,其中在低溫脅迫1 d時GR活性均達到最高,分別較0 d顯著提高56.15%、47.07%和77.26%。低溫脅迫2 d時根中GR活性與低溫脅迫1 d時無顯著差異,但莖和葉中GR活性均較低溫脅迫1 d時顯著降低。可見,低溫脅迫提高了棉花幼苗根、莖和葉中GR活性,而隨著低溫脅迫時間的延長,GR活性略降低。說明棉花幼苗營養(yǎng)器官可通過提高GR活性來維持或增加GSH含量,以保持膜蛋白結構的穩(wěn)定性,減輕低溫造成的傷害。

3 討論

正常情況下,植物細胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。低溫等逆境脅迫下,植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量ROS,細胞膜脂發(fā)生過氧化反應,造成細胞凋亡或壞死,進而引起根、莖和葉生理生化代謝紊亂,體內(nèi)礦物質(zhì)吸收和養(yǎng)分運轉(zhuǎn)受阻,最終導致植物生長發(fā)育緩慢[5-7]。同時,低溫也可以誘發(fā)植物建立防御體系,調(diào)控組織內(nèi)抗氧化酶活性和抗氧化非酶物質(zhì)含量,協(xié)同清除組織中的ROS,避免或減輕ROS對細胞造成傷害,維持細胞膜的完整性和穩(wěn)定性。AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中重要組成酶為APX、DHAR、MDHAR、GPX和GR,抗氧化非酶物質(zhì)為AsA、DHA、GSH和GSSG,該系統(tǒng)在低溫等逆境下清除植物體內(nèi)ROS方面作用顯著[25-27]。

AsA是AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中清除ROS的重要抗氧化非酶物質(zhì),可在APX作用下與H2O2反應,H2O2接受以GSH為中介的NADPH電子還原生成H2O,清除H2O2的毒性,并且AsA可被氧化形成MDHA,部分MDHA進一步氧化形成DHA,AsA也可由MDHA和DHA分別在DHAR和MDHAR的催化下再生[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn),棉花幼苗根中AsA含量隨著低溫脅迫時間的延長呈先不變后增加的趨勢,且DHA含量呈先下降后上升的趨勢,而AsA/DHA比率表現(xiàn)為先升高后顯著下降的趨勢,其原因可能是根在低溫脅迫1 d時APX活性顯著降低(較0 d下降16.77%),導致AsA轉(zhuǎn)化水平下降,引起DHA含量顯著降低,使得低溫脅迫1 d時AsA/DHA比率增大;低溫脅迫2 d時APX、MDHAR和DHAR活性升高,使AsA和DHA含量均增加,但DHA含量增幅較大,導致低溫脅迫2 d時AsA/DHA比率下降,說明隨著低溫脅迫時間的延長,棉花幼苗根清除ROS能力逐漸減弱,低溫對棉花幼苗根造成的傷害越大,可能是幼苗根中無葉綠體,抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量整體水平較低導致的[30]。本研究亦發(fā)現(xiàn),棉花幼苗莖中DHA含量隨著低溫脅迫時間的延長表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢,而AsA含量和AsA/DHA比率顯著增加33.33%～110.56%和105.47%～141.80%,可能是與0 d相比,低溫脅迫1 d時DHAR和MDHAR活性升高,造成AsA含量增加,使得DHA含量減少,而低溫脅迫2 d時APX、DHAR和MDHAR活性顯著升高,引起AsA和DHA含量顯著增加,但DHA含量仍未達到0 d水平,最終導致AsA/DHA比率逐漸增大。本試驗結果表明,棉花幼苗葉中AsA、DHA含量及AsA/DHA比率均隨著低溫脅迫時間的延長呈增加趨勢,可能是低溫脅迫過程中APX、DHAR和MDHAR活性的升高增加了AsA轉(zhuǎn)化和生成速率,但生成速率高于轉(zhuǎn)化速率,同時引起DHA含量增加,導致葉中AsA/DHA比率增大。本研究結果與低溫脅迫對水稻[31-32]、油菜[33]和番茄[34]的結果較為相似。

GSH是AsA-GSH循環(huán)中重要的抗氧化劑之一,較高的GSH庫可維持膜蛋白結構穩(wěn)定,GPX和DHAR能特異催化GSH生成GSSG;而GR可反向催化GSSG生成GSH,且其活性與細胞GSH庫的水平密切相關[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn),棉花幼苗根中GSH含量在低溫脅迫過程中減少9.68%～14.12%,GSSG含量增加15.93%～33.79%,GSH/GSSG比率顯著降低21.75%～35.53%,原因可能是低溫脅迫處理下DHAR和GR活性顯著升高,且GPX活性維持在較高水平,使GSH含量略有下降,GSSG含量增加,最終引起GSH/GSSG比率下降。本研究還發(fā)現(xiàn),棉花幼苗莖中GSH含量隨著低溫脅迫時間的延長逐漸增加,而GSSG含量呈先降低后增加的趨勢,GSH/GSSG比率無顯著差異,其原因可能是低溫脅迫1 d時GR活性顯著升高及GPX和DHAR活性無顯著差異,導致GSH含量增加和GSSG含量減少,而在低溫脅迫2 d時GPX活性略微增加,GR和DHAR活性顯著高于0 d時,使得GSH和GSSG含量均增加,且增幅較一致,最終導致莖中GSH/GSSG比率升高不明顯。本試驗表明,棉花幼苗葉中GSH含量隨著低溫脅迫時間延長顯著增加6.08%～16.60%,GSSG含量無顯著差異,與0 d相比,GSH/GSSG比率在低溫脅迫1 d時無顯著差異,但在低溫脅迫2 d時顯著增加17.50%,可能是因為低溫脅迫1和2 d時GR和DHAR活性均升高,使GSH含量增加,而在DHAR和GPX作用下,GSSG含量維持在正常狀態(tài),從而導致GSH/GSSG比率升高。本研究結果與低溫脅迫對甘藍[12]、甜櫻桃[35]、黃豆[37]和油菜[38]的研究結果較一致。

4 結論

本研究結果表明,低溫脅迫可以增加棉花幼苗根、莖或葉中AsA和GSH等抗氧化物質(zhì)含量,提高AsA/DHA和GSH/GSSG比率,提高或維持APX、DHAR、MDHAR、GPX和GR等抗氧化酶活性,即通過調(diào)整AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)來清除ROS,以減輕低溫傷害,其中低溫對棉花幼苗根AsA-GSH循環(huán)影響最大。由于低溫脅迫會產(chǎn)生大量ROS,而本試驗未對低溫脅迫下棉花幼苗營養(yǎng)器官中相對電導率、丙二醛含量、過氧化氫含量以及超氧陰離子、羥基自由基及ROS產(chǎn)生速率等ROS代謝關鍵指標進行研究,下一步應結合這些關鍵指標與生理指標,探索棉花幼苗耐低溫相關機理。