肖 爽 韓雨辰 號宇然 王曉蕾 劉連濤 孫紅春 張永江 李存東

(河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/省部共建華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/河北省作物生長調(diào)控重點實驗室,河北 保定 071001)

土壤鹽漬化是農(nóng)作物生產(chǎn)中面臨的主要脅迫因素之一,土壤鹽分是影響作物出苗率的重要因素[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計,全球鹽堿化土地約9.5億hm2,占全球陸地面積的10%,且土壤次生鹽堿化面積還在不斷增加[2]。第二次全國土壤普查資料顯示,我國鹽漬土面積為9 913萬hm2,常規(guī)作物在鹽分較高的土壤中無法正常生長,嚴重制約我國種植業(yè)的發(fā)展[3]。

棉花(GossypiumhirsutumL.)是世界性的重要經(jīng)濟作物,耐鹽性較強,被譽為鹽堿地上的“先鋒植物”[4]。據(jù)報道,土壤中存在適度的鹽可以促進棉種萌發(fā)、棉苗生長,以及產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的改善,雖然棉花對鹽堿有一定的忍耐力,但當土壤中鹽分過高時則會給棉花的生長帶來不可逆的危害,導致棉花出苗率降低,甚至引起產(chǎn)量下降[5]。種子萌發(fā)作為種子植物生命周期的起始和關(guān)鍵階段,其優(yōu)劣將直接影響棉花的正常生長,最終決定其產(chǎn)量和品質(zhì)[6-8]。且萌發(fā)階段也是作物對鹽脅迫最敏感的時期,鹽脅迫可引起滲透脅迫、離子失衡和氧化損傷等[9],阻礙種子滲透吸水,進而影響種子萌發(fā),并對作物生長和產(chǎn)量產(chǎn)生影響[10]。因此,種子萌發(fā)階段的耐鹽性是表征棉花抗鹽能力的重要依據(jù)之一[4]。

目前有大量研究通過一些物理、化學方法處理種子,以達到促進作物生長、種子萌發(fā),進而提高種子抗逆性和種子活力的目的[11-13]。其中,種子引發(fā)是一項有效提高種子活力的處理技術(shù),該技術(shù)又稱為滲透調(diào)節(jié),由Heydecker等[14]首次提出,是一種可以提高種子抗逆性的處理方法[15]。目前該方法已經(jīng)發(fā)展成一種不可或缺的增強植物抗逆性的方法[16],在種子萌發(fā)前用天然或合成物質(zhì)對種子進行處理,使其產(chǎn)生特異生理反應(yīng),是一種對其不造成傷害的預(yù)處理技術(shù)[17]。目前大量研究發(fā)現(xiàn)種子引發(fā)可以增強種子在脅迫環(huán)境下的活力,改善種子發(fā)芽情況,加快種子出苗速度,使出苗整齊一致[18]。種子的引發(fā)效果通常會因引發(fā)溫度、引發(fā)時間、種子類型和引發(fā)劑種類的不同而異[19-20]。

本研究以種子引發(fā)的方式處理棉花種子,以聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG-6000)作為引發(fā)劑,分析種子引發(fā)對鹽脅迫下棉種萌發(fā)的影響,旨在探究PEG作為引發(fā)劑提高種子活力的機理,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)利用提供參考依據(jù),為進一步提高鹽漬化土壤中棉花的出苗率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗于2018—2019年于河北農(nóng)業(yè)大學棉花生理生態(tài)實驗室進行。供試棉花品種為國欣棉9號,由河北河間國欣農(nóng)研會提供。PEG-6000購于北京索萊寶科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫(H2O2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所;根系活力測定試劑盒購于北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 最佳引發(fā)條件篩選

1.2.1 引發(fā)方法 種子引發(fā)與回干處理參照閔丹丹等[21]的方法。使用5%次氯酸鈉對棉花種子消毒15 min,流水沖洗2min,然后用不同質(zhì)量濃度(0、50、100、150 g·L-1)的PEG-6000于15℃黑暗環(huán)境下各引發(fā)6、12、24 h。待達到相應(yīng)的引發(fā)時間后將種子取出,用蒸餾水快速沖洗種子數(shù)次后用吸水紙將種子表面的水分吸干,于室內(nèi)通風處(20～25℃,相對濕度40%～45%)回干,通過稱重法確定種子含水量達到初始含水量后即可用于后續(xù)發(fā)芽試驗。

1.2.2 發(fā)芽試驗 在25℃黑暗條件下對不同引發(fā)處理回干后的種子進行發(fā)芽試驗。采用紙上萌發(fā)法,培養(yǎng)皿和濾紙經(jīng)121℃高溫滅菌20min。將供試種子均勻排放于兩層濾紙上,種子上部再加蓋一層濾紙,之后分次均勻地滴入10 mL蒸餾水,使上下層濾紙全部潤濕,每皿放置50粒,每處理設(shè)置6個重復,以未經(jīng)引發(fā)的種子作為對照(CK)。每24 h視情況補充培養(yǎng)皿內(nèi)蒸餾水。

1.2.3 測定項目 以芽長超過種子長度1/2記為發(fā)芽,2 d內(nèi)無種子發(fā)芽視為發(fā)芽試驗結(jié)束(本試驗為7 d),根據(jù)公式計算發(fā)芽勢(germination potential,GP)與發(fā)芽率(germination rate,GR)[22]:

1.3 鹽脅迫對引發(fā)和未引發(fā)種子萌發(fā)特性的影響

1.3.1 試驗設(shè)計 利用1.2中篩選出的最佳引發(fā)條件對種子進行引發(fā)(引發(fā)和回干操作同1.2.1)。使用未引發(fā)和引發(fā)后經(jīng)過回干的種子在前期預(yù)試驗確定的0、50、100、150 mmol·L-1NaCl溶液中進行發(fā)芽試驗,每處理設(shè)置6次重復,每重復50粒種子,以未經(jīng)引發(fā)的種子作為對照(CK)。

1.3.2 測定指標 發(fā)芽試驗期間每天記錄發(fā)芽種子數(shù),除計算GP、GR外,按照公式計算發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI)[23]、活力指數(shù)(vital index,Ⅵ)[24]和平均發(fā)芽時間(mean germination time,MGT)[25]:

于萌發(fā)試驗的第2、第4、第6天將棉種種皮剝除后,按照試劑盒說明測定各處理種子SOD、POD活性和MDA含量。并于萌發(fā)試驗7 d切取各處理的棉花幼根,使用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenytetrazoliumchloride,TTC)比色法測定根系活力,具體測定方法按試劑盒說明操作,每處理設(shè)置3次重復;使用Epson Perfection V330掃描儀(日本Suwa公司)對萌發(fā)7 d后的棉種幼根進行掃描,以TIF圖像文件存檔,用WinRHIZOTron MF 2012a根系分析軟件(Regent Instruments Inc.,Quebec,Canada)對幼根的形態(tài)數(shù)據(jù)進行分析,每處理設(shè)置5次重復。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)通過使用SPSS 22.0進行單因素方差分析(ANOVA)后做平均值多重比較(Duncan),顯著性檢驗水平為5%。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子引發(fā)條件篩選

由表1可知,與CK相比,PEG-6000濃度為0(即蒸餾水)引發(fā)6、12、24 h對棉種的發(fā)芽勢幾乎沒有影響,蒸餾水引發(fā)12 h后反而使發(fā)芽率發(fā)生了顯著下降。使用5%PEG-6000對種子進行6、12、24 h的引發(fā)均會造成棉種發(fā)芽勢顯著提升,分別比CK提高了13.34、20.67和16.67個百分點;但到種子萌發(fā)的最后階段,唯有引發(fā)12 h棉種的發(fā)芽率與CK相比達到了顯著性水平,說明不同濃度的PEG-6000可能是通過促進種子萌發(fā)前期的發(fā)芽速度來提高種子發(fā)芽率的。當PEG-6000濃度提高至10%后,引發(fā)6 h和12 h種子的發(fā)芽勢與CK相比顯著提高了7、67和19.67個百點,僅引發(fā)12 h種子的發(fā)芽率較CK顯著提升。當PEG-6000濃度提高至15%之后,引發(fā)處理對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率呈現(xiàn)出顯著的抑制作用。綜合上述結(jié)果可知,以5%PEG-6000引發(fā)12 h為最佳的棉種引發(fā)條件。

表1 不同引發(fā)劑和引發(fā)時間對種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響Table1 Effect of different primer and priming time on GP and GR

2.2 鹽脅迫下引發(fā)和未引發(fā)處理對棉種萌發(fā)特性的影響

由圖1可知,不同濃度NaCl脅迫對棉種萌發(fā)均具有抑制作用,且隨著NaCl濃度的升高,引發(fā)和未引發(fā)種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢均呈現(xiàn)下降的趨勢。在0、50、100、150 mmol·L-1NaCl脅迫下,經(jīng)過引發(fā)種子的發(fā)芽勢較未引發(fā)種子分別提高了32.67、25.67、30.33和18.00個百分點,均達到了顯著水平(圖1-A)。雖然引發(fā)處理對鹽脅迫下種子發(fā)芽率的影響幅度沒有發(fā)芽勢明顯,但仍顯著促進了不同鹽濃度下種子的萌發(fā),與未引發(fā)種子相比,引發(fā)后種子的發(fā)芽率在0、50、100 mmol·L-1的NaCl脅迫下提高了19.20、19.33、34.80和23.00個百分點,至NaCl濃度達到150 mmol·L-1,其發(fā)芽率是未引發(fā)種子的2倍多(圖1-B)。

棉種發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的變化趨勢均與NaCl濃度的變化趨勢大體表現(xiàn)出負相關(guān),即隨著NaCl濃度的提高呈逐漸降低的趨勢(圖2),說明50～150 mmol·L-1NaCl會抑制棉種的萌發(fā)。在不同濃度的鹽脅迫下,引發(fā)后的種子發(fā)芽指數(shù)是未引發(fā)種子的2.08～3.95倍(圖2-A)。在0、50、100、150mmol·L-1NaCl脅迫下,活力指數(shù)分別較未引發(fā)的種子提高了161.83%、135.21%、310.83%和444.53%(圖2-B)。而引發(fā)處理僅在0、150 mmol·L-1NaCl脅迫下顯著縮短了平均發(fā)芽時間(圖2-C)。

2.3 鹽脅迫下引發(fā)和未引發(fā)處理對棉種形態(tài)特性的影響

由表2可知,引發(fā)、未引發(fā)的棉花種子在0～150 mmol·L-1NaCl脅迫下其下胚軸長和根長均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,且高峰皆在50 mmol·L-1NaCl處理,說明低濃度的NaCl對棉花種子的下胚軸長和根長具有一定的促進作用。經(jīng)過引發(fā)處理的種子在0、50、100、150 mmol·L-1NaCl處理下,下胚軸長分別較未引發(fā)棉種提高了17.95%、30.37%、19.92%和39.05%,根長分別提高了16.60%、12.93%、20.87%和36.78%。但根表面積和平均根系直徑并未隨之增加,反而使主根更加細長。

2.4 鹽脅迫下引發(fā)和未引發(fā)處理對棉種根系活力的影響

由圖3可知,無論種子是否經(jīng)過引發(fā)處理,在不同濃度NaCl脅迫下進行發(fā)芽試驗7 d后,其根系活力均隨著NaCl濃度增加呈逐漸降低的趨勢,同時也可以看出種子引發(fā)處理能夠增強鹽脅迫下的根系活力,在0、50、100、150 mmol·L-1NaCl脅迫下,引發(fā)處理后的根系活力較未引發(fā)處理增加了6.84%～39.32%,并在NaCl濃度為0、50、150 mmol·L-1時達到顯著水平。

2.5 鹽脅迫下引發(fā)和未引發(fā)處理對棉種SOD、POD活性的影響

由圖4-A可知,隨著NaCl濃度的升高,萌發(fā)2、4、6 d種子的SOD活性整體均呈降低趨勢,且隨著萌發(fā)時間的延長SOD活性呈下降趨勢。萌發(fā)2 d時,在0、50、100、150mmol·L-1NaCl濃度脅迫下,引發(fā)處理種子的SOD活性較未引發(fā)種子分別提高了18.27%、7.81%、4.39%和15.43%,且差異均達到了顯著性水平。萌發(fā)4 d時,在0、50、100 mmol·L-1NaCl濃度下,引發(fā)處理種子的SOD活性分別較未引發(fā)種子提高了25.62%、21.38%和0.92%。進入萌發(fā)6 d,雖然SOD的整體活性較萌發(fā)試驗前期下降,但是引發(fā)處理的種子在0～150mmol·L-1NaCl脅迫下的SOD活性仍較未引發(fā)種子提高了8.62%、30.71%、35.81%和38.85%。由圖4-B知,無論種子是否經(jīng)過引發(fā)處理,POD活性均隨著萌發(fā)時間的延長而下降。萌發(fā)2 d時,引發(fā)種子的POD活性僅在50 mmol·L-1NaCl下顯著高于未引發(fā)種子。至萌發(fā)4 d,種子內(nèi)部的POD活性發(fā)生驟降,在0、50、100 mmol·L-1NaCl濃度下,引發(fā)種子較未引發(fā)種子降低了0.75%、34.50%和1.74%,僅在高濃度鹽脅迫下(150 mmol·L-1)引發(fā)處理對種子內(nèi)部的POD活性表現(xiàn)出了促進作用。萌發(fā)6 d時,種子POD活性繼續(xù)下降,但引發(fā)處理對種子POD活性的促進作用愈發(fā)明顯,在0、100、150 mmol·L-1NaCl脅迫下,引發(fā)種子的POD活性較未引發(fā)種子分別提高了41.56%、9.51%和15.42%。

表2 引發(fā)與未引發(fā)處理對鹽脅迫下種子形態(tài)特征的影響Table2 Effect of seed priming and unpriming under salt stress on seed morphological characteristics

2.6 鹽脅迫下引發(fā)和未引發(fā)處理對棉種H2O2、MDA含量的影響

由圖5-A可知,在種子萌發(fā)的過程中,引發(fā)處理對種子內(nèi)部H2O2積累有明顯的抑制作用。在萌發(fā)2、4、6 d時,不同濃度NaCl脅迫下,經(jīng)過PEG-6000引發(fā)的棉花種子內(nèi)部H2O2較未引發(fā)種子分別降低1.22%～32.34%、5.14%～29.57%、11.68%～27.14%,除在萌發(fā)2 d時50mmol·L-1NaCl濃度脅迫下差異不顯著,其余各處理組間差異顯著。由圖5-B可知,不同濃度NaCl脅迫下,各萌發(fā)時期引發(fā)種子的MDA含量均顯著低于未引發(fā)種子(除150 mmol·L-1NaCl濃度脅迫下萌發(fā)4 d時),在萌發(fā)2、4、6 d時,分別降低了8.00%～39.06%、0.26%～33.15%、7.92%～22.32%。

3 討論

棉花作為一種“耐鹽喜鈉”作物,具有較強的耐鹽性[26],而我國植棉區(qū)大多位于旱地、輕度鹽堿地等貧瘠土地[27]。棉花對鹽脅迫的忍耐能力在不同生育時期存在一定的差異,但以萌發(fā)期和苗期對鹽分最為敏感[28]。本研究對棉花種子進行PEG引發(fā)處理后在不同濃度NaCl脅迫下進行萌發(fā)試驗,通過衡量種子萌發(fā)指標,幼根形態(tài)發(fā)育情況,種子內(nèi)部抗氧化酶活性及膜脂過氧化水平分析引發(fā)處理對鹽脅迫下棉種萌發(fā)過程的影響。

3.1 PEG引發(fā)處理對鹽脅迫下棉種萌發(fā)的影響

雖然棉花感受鹽害的外部表現(xiàn)因脅迫的強度、時間的不同而異,但大多表現(xiàn)為種子吸脹困難,進而造成萌發(fā)緩慢和發(fā)芽率低的現(xiàn)象[29]。目前有大量研究認為鹽脅迫對種子萌發(fā)有顯著的抑制作用[30]。本研究證實了該觀點,發(fā)現(xiàn)50～150 mmol·L-1NaCl脅迫對棉種萌發(fā)具有顯著的抑制作用,且發(fā)芽勢、發(fā)芽率均隨NaCl濃度的升高而下降。

發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間是評價種子發(fā)芽的常用指標,可以反映種子的發(fā)芽速度、整齊度和幼苗健壯的潛勢[31]。但在自然貯藏條件下,棉種的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及種子活力易發(fā)生下降,導致棉籽利用價值降低[32]。有報道顯示,成功進行引發(fā)的種子其抗性、活力、萌發(fā)率、出苗整齊率、成活率等均可得到有效改善[33]。

經(jīng)篩選試驗后,使用5%PEG-6000對棉種引發(fā)12 h后開展發(fā)芽試驗,發(fā)現(xiàn)引發(fā)種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率較未引發(fā)種子得到了顯著的提升。為了衡量引發(fā)處理對種子耐鹽性的影響,將引發(fā)后的種子在0、50、100、150 mmol·L-1NaCl脅迫下進行發(fā)芽試驗,以未引發(fā)種子作為對照,發(fā)現(xiàn)除平均發(fā)芽時間外,其余可衡量種子萌發(fā)性能的指標均隨著鹽濃度的提高呈逐漸下降的趨勢;使用PEG-6000引發(fā)后種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均較對照顯著提高,說明引發(fā)處理能夠提升棉花種子的萌發(fā)特性。

有研究顯示低濃度鹽脅迫能夠促進種子萌發(fā),陳火英等[34]在番茄種子萌發(fā)的研究中發(fā)現(xiàn)低濃度鹽脅迫處理的發(fā)芽率均高于對照;張利霞等[35]對夏枯草種子的研究也得到了相似結(jié)論,說明適當濃度的鹽脅迫對棉花種子萌發(fā)具有促進作用,當鹽脅迫濃度高于臨界值時則會受到抑制。本研究在低濃度鹽脅迫下未發(fā)現(xiàn)棉種發(fā)芽率的提升,但在萌發(fā)7 d時發(fā)現(xiàn)棉花幼根的下胚軸長及根長在50 mmol·L-1NaCl脅迫下會鹽脅迫出現(xiàn)顯著的增長,可能是由于低濃度鹽脅迫對種子萌發(fā)的促進作用。

3.2 PEG引發(fā)處理對鹽脅迫下幼根根系活力的影響

種子萌發(fā)是植物世代循環(huán)中最重要、最脆弱的階段,也是多因素參與的復雜調(diào)控過程[36]。根系活力是作物耐鹽性的重要參考指標之一,常用于衡量植物根系的吸收、合成能力[37]。還有報道顯示根系活力同樣是衡量植物根系抗逆能力的重要指標,可以反映植物的抗鹽能力[38]。本研究結(jié)果同樣印證了該結(jié)論,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過5%PEG-6000引發(fā)12 h后,萌發(fā)7 d后的根系活力發(fā)生了不同程度的提高。

3.3 PEG引發(fā)處理對鹽脅迫下抗氧化酶活性的影響

植物在不利條件下生長會導致ROS過度積累進而引起脂質(zhì)過氧化,損害細胞膜結(jié)構(gòu)[39],而植物體內(nèi)的保護酶系能有效清除膜脂過氧化過程中產(chǎn)生的氧自由基等有害物質(zhì),對增強抗逆性、維持植物體正常生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用[40]。SOD可將組織中的O2-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2,再由POD將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2,從而有效地降低自由基對植物體的傷害,因此在逆境條件下,SOD和POD等保護酶能否維持較高的活性對植物具有重要意義[41]。本研究發(fā)現(xiàn)種子內(nèi)部的SOD活性隨著鹽濃度的不斷升高呈下降趨勢,說明鹽脅迫會抑制種子內(nèi)部的SOD活性,且隨著脅迫濃度的增強,抑制效果愈加明顯;而經(jīng)過引發(fā)處理的種子在鹽脅迫下的SOD活性較未引發(fā)處理出現(xiàn)了不同程度的增加。POD活性在不同濃度鹽脅迫下的變化趨勢與SOD類似,但是隨著脅迫時間的推進POD活性呈現(xiàn)出明顯的下降,且引發(fā)處理對POD活性的促進作用并沒有SOD明顯,說明相對于POD,SOD可能對PEG-6000引發(fā)處理更為敏感,這與楊振亞等[42]在干旱脅迫下毛竹種子萌發(fā)研究中的結(jié)果相似。

3.4 PEG引發(fā)處理對緩解鹽脅迫下棉種膜脂過氧化水平的影響

隨著脅迫強度的增加和脅迫時間的延長,膜脂過氧化會進一步加重,同時SOD和POD活性降低,致使H2O2過多積累而導致膜脂過氧化,從而破壞細胞膜的穩(wěn)定性[43-44]。MDA是膜脂過氧化的主要副產(chǎn)物,通常被作為植物細胞膜損傷程度的指示物[45],H2O2含量能夠反映NaCl脅迫對細胞膜結(jié)構(gòu)完整性的破壞程度[46]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與未引發(fā)相比,引發(fā)后處于萌發(fā)各時期的棉種MDA與H2O2含量均發(fā)生了不同程度的降低,推測PEG引發(fā)處理可能是通過直接清除或抑制二者的合成途徑來緩解膜脂過氧化水平,進而促進了棉種萌發(fā),然而其降低膜脂過氧化水平的具體調(diào)控機理還需要進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,在0～150 mmol·L-1NaCl脅迫下,使用5%PEG-6000對棉花種子進行引發(fā)處理可以提高發(fā)芽勢和發(fā)芽率,縮短平均發(fā)芽時間,并使種子發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)出現(xiàn)了不同幅度的增長;此外,引發(fā)處理對萌發(fā)7 d種子幼根的外部形態(tài)(下胚軸、根長)同樣產(chǎn)生了促進作用。引發(fā)處理在種子生理特性的影響方面,除了對根系活力產(chǎn)生積極作用外,還增強了種子內(nèi)部SOD和POD的活性,并通過減少H2O2和MDA的積累,緩解膜脂過氧化水平以增強棉花種子萌發(fā)過程中的耐鹽性。然而,種子引發(fā)技術(shù)對鹽脅迫條件下大田栽培棉花植株的生長發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)的影響還有待于進一步研究。