李崇豪 張卓濰 陳 康 戴志遠 沈 清

(1 浙江工商大學海洋食品研究院/浙江省水產品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310012；2新昌縣鱘鰉魚生物科技有限公司，浙江 紹興 312500)

傳統(tǒng)的煙熏工藝不僅能提高食品的保質期，而且能賦予食品特殊的煙熏香味[1]，但也會產生苯并芘[benzo(a)pyrene，BaP]等一系列致癌物[2-3]。BaP 是苯與芘稠合而成的一類多環(huán)芳烴[4]，主要由高溫條件下煙熏材料不完全燃燒或還原性氣體環(huán)境中熱分解產生，其分布廣泛、性質穩(wěn)定、致癌性強，是主要的環(huán)境和食品污染物[5]，而常規(guī)煙熏工藝制備的即食魚片中BaP 含量高達24.1 μg·kg-1。BaP 可經過食道、呼吸、皮膚吸收等方式進入人體，并通過血液循環(huán)在人體主要器官中沉積，嚴重威脅消費者的生理和心理健康[6-7]。

目前煙熏過程中BaP 含量的控制主要通過熏煙過濾技術、發(fā)煙材料改進、煙熏工藝優(yōu)化和使用抑制劑等方法。宋忠祥等[8]采用熏煙水霧過濾技術，通過將凈化后的煙氣噴淋到產品表面，大幅度降低了煙熏過程中BaP 的產生。鐘昳茹等[9]以湖南臘肉材料，對比了樹枝、鋸末、米糠、木粒、雜木5 種發(fā)煙材料對煙熏過程中BaP 含量的影響，發(fā)現(xiàn)不同煙熏材料產生的BaP含量不同，其中鋸末產生的BaP 含量最低。此外，干燥的發(fā)煙材料比潮濕狀態(tài)的發(fā)煙材料所產生的BaP含量低[10]。煙熏的溫度、時間和方式也會導致BaP 含量的改變，Kazerouni 等[11]對高溫與低溫條件下煙熏過程中所產生的BaP 含量進行研究，結果表明高溫條件下所產生的BaP 含量更高；研究還發(fā)現(xiàn)，隨著煙熏時間的延長，BaP 會滲入肉制品中[12]。

本試驗以鱘魚片為原料，通過前置固相吸附裝置在線篩濾熏煙中BaP 類化合物，比較分子篩、硅膠等固相填料對煙熏魚片中BaP 和芳香性風味物質的影響，并采用響應面法優(yōu)化加工工藝，旨在截留熏煙中BaP 類化合物的同時最大保留芳香類化合物，為開發(fā)新型安全的煙熏食品提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱘魚肉，新昌縣鱘鰉魚生物科技有限公司；乙腈(分析純)、正己烷(分析純)、氫氧化鉀，國藥集團化學試劑有限公司；BaP 標準品(純度≥96%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；活性氧化鋁、分子篩和硅膠(150 目，比表面積≥400 m2·g-1，孔容0.9 mL·g-1)，北京百靈威科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

RYX-25 型煙熏爐，嘉興市瑞邦機械工程有限公司；Triplus SPME 自動進樣器、Trace GC Ultra 氣相色譜儀、DSQII 單四級桿色譜質譜儀，美國Thermo Fisher Scientific 公 司； 100 μm 聚 二 甲 基 硅 氧 烷(polydimethylsiloxane，PDMS)萃取頭，美國Supelco 公司；Waters 2695 高效液相色譜儀配2489UV/Vis 紫外檢測器，美國Waters 公司；HGC-36 氮吹儀，天津恒奧科技發(fā)展有限公司；SK7200LHC 超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙熏即食魚片的制備 首先將魚肉解凍切成長5 cm、寬4 cm、厚1 cm 的魚片，放入腌制液(鹽76 g、糖6.6 g、姜6.6 g、味精6.6 g、料酒16.8 g 配成1 L 溶液)中腌制40 min。然后在室溫條件下干燥30 min。最后在干燥溫度40℃(烘箱中干制)，干燥時間30 min，煙熏溫度85℃，煙熏時間30 min 條件下進行熏制[13]。

1.3.2 前置固相吸附劑裝置 分別設棉花、活性氧化鋁、分子篩和硅膠4 種前置固相吸附材料。將棉花平鋪在200 目特制不銹鋼網篩上至1 mm 厚，向內填充20 g 活性氧化鋁、分子篩或硅膠，棉花作為吸附材料時，將其平鋪在不銹鋼網篩上約2 cm 厚，然后將其固定至出煙口。

1.3.3 BaP 含量測定 準確稱取100 mg BaP 標準品，置于100 mL 棕色容量瓶，乙腈定容，制備濃度為1.0 mg·mL-1儲備液，置于4℃冰箱中避光保存。精密吸取定量的標準品儲備液，分別配制成質量濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 和1 μg·mL-1標準溶液，經0.22 μm 有機濾膜過濾后轉移置樣品瓶中。液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)條件為柱溫30℃，流速0.8 mL·min-1，紫外檢測器波長262 nm，流動相為乙腈水溶液(80 ∶20，v/v)，運行時間25 min，進樣20 μL。經檢測后根據樣品濃度和BaP 信號峰面積繪制標準曲線[14]。

準確稱取5 g 魚片樣品，研磨后移入150 mL 具塞錐形瓶，加入30 mL 2 mol·L-1KOH 溶液，塞緊瓶塞，置于70℃恒溫水浴鍋2 h；取出錐形瓶，加入30 mL 正己烷，超聲提取30 min；再加入30 mL 水充分振蕩，然后靜置到正己烷相與水相分離。取15 mL上層正己烷相，經氮吹儀吹干，準確加入1 mL 乙腈，振蕩溶解后，經0.22 μm 有機濾膜過濾，用于HPLC檢測。通過比較樣品與標準樣品的保留時間進行定性分析，樣品保留時間對應的峰值與標準曲線換算進行定量分析。

1.3.4 風味物質檢測 將熏魚肉剪碎，稱取3 g 于10 mL 樣品瓶中，60℃水浴30 min，推出纖維頭萃取30 min 后取出，在進樣口250℃解析3 min。萃取頭第一次使用時，在氣相色譜/質譜(gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS)進樣口250℃老化2 h，以后每次使用前只需老化30 min。

GC/MS 分析采用TR-5MS 毛細管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氮氣，進樣口溫度250℃，流速1 mL·min-1，進樣方式為不分流，起始溫度35℃，保持6 min，以4℃·min-1升至80℃，8℃·min-1升至200℃，12℃·min-1升至250℃，保持5 min。電離方式EI，電子能量70 eV，燈絲發(fā)射電流200 μA，離子源溫度230℃，接口溫度250℃，掃描范圍30～450 m/z[15]。

1.3.5 感官評價 挑選20 名經過感官培訓的食品專業(yè)學生組成評價小組，從樣品的色澤、質地、異味、煙熏味、回味等方面進行感官評價。所有樣品統(tǒng)一評定，隨機取樣。評價人員的基本條件為身體健康，個人衛(wèi)生良好，對感官分析具有較強的興趣，沒有抽煙的不良嗜好。在檢測前不吃東西，不使用氣味濃烈的香水與化妝品。評定過程中禁止討論，評定限時15 min[16]。評定完一組樣品后，用清水漱口再進行下一組樣品的評定，具體評價標準見表2。

1.3.6 單因素試驗與響應面優(yōu)化試驗 分別考察硅膠含量、煙熏溫度和煙熏時間對煙熏鱘魚中BaP 含量的影響，試驗條件優(yōu)化如下:不同硅膠含量(10 ～30 g)，不同煙熏時間(20～40 min)和不同煙熏溫度(80 ～100℃)，測定各組煙熏鱘魚樣品中BaP 含量。

在單因素試驗基礎上，根據Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，選取前置固相吸附劑硅膠含量(X1)、煙熏時間(X2)、煙熏溫度(X3)為自變量，煙熏鱘魚片BaP 含量為因變量，進行三因素三水平的響應面設計，得到煙熏工藝的最優(yōu)條件。響應面試驗因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 The experimental design of factors and level tables

1.4 數(shù)據分析

每個樣品平行測定3 次，結果以平均值±標準誤表示，采用SPSS v17.0 進行差異顯著性分析，使用Design-Expert 8.05 進行響應面試驗設計與分析，并用Microsoft Word 2010、Origin 7.5 及Microsoft Excel 2010軟件進行圖表繪制。

表2 煙熏鱘魚片的感官評價標準Table 2 The sensory evaluation criteria of smoked sturgeon fillets

2 結果與分析

2.1 不同前置固相吸附劑條件下煙熏鱘魚片的感觀評分

由圖1 可知，不同前置吸附材料導致煙熏鱘魚片的感官評分差距較大，其中未添加前置固相吸附劑與硅膠固相吸附的感官評價最好，且二者的得分區(qū)間較相近。棉花和活性氧化鋁作為固相吸附劑時，煙熏鱘魚片的煙熏味評分較低，說明二者對具有煙熏風味化合物的截留效果較好。以分子篩作為固相吸附劑的煙熏鱘魚片色澤較淡，因為表面分子篩具有一定的脫色作用。此外，以分子篩為固相吸附劑會引入一定的異味，可能是因為煙熏味不能有效覆蓋魚片本身的腥味等異味。

圖1 不同固相吸附劑條件下煙熏鱘魚片的感觀評分Fig.1 Sensory score of smoked fish fillets under different adsorbent conditions

2.2 不同前置固相吸附劑的BaP 含量測定

以濃度(μg·mL-1)為X軸，峰面積為Y軸，得到制備標準曲線回歸方程為Y=296 623X，R2=0.999，結果表明在0.001 ～1 μg·mL-1范圍內，質量濃度與峰面積呈良好的線性關系，符合定量的標準。試驗確定的色譜條件下BaP 的保留時間為14.4 min，通過保留時間與峰面積確定不同前置固相吸附劑條件下BaP 的含量，結果見圖2。

結果表明，添加前置吸附劑與未添加組相比，煙熏鱘魚片中BaP 含量明顯下降，其中高分子材料(分子篩、活性氧化鋁)的吸附效果最佳，棉花、硅膠的吸附效果次之。何智慧等[17]將高分子材料添加到卷煙濾嘴中，BaP 含量下降了24.5%。程占剛等[18]研制了高分子多孔過濾煙嘴，檢測發(fā)現(xiàn)BaP 含量減少了35.0%。研究表明，硅膠對芳香烴化合物有一定的吸附作用，且經過優(yōu)化的硅膠吸附效果較普通硅膠好[19]，而目前關于棉花對BaP 的吸附作用機制尚未確定。

圖2 不同固相吸附劑條件下煙熏鱘魚片中BaP 含量Fig.2 The content benzopyrene content under different sorbents

2.3 不同吸附劑下熏魚的風味物質

揮發(fā)性物質通過在NIST 2.0 譜庫中做自動檢索分析，且僅當正反匹配度(SI/RSI)均大于800(最大值為1 000) 的鑒定結果才予以保留，所得主要的揮發(fā)性化合物種類和含量見表3。

表3 不同前置吸附劑條件下煙熏鱘魚片風味物質分析結果Table 3 Analysis of flavor compounds of smoked sturgeon under different pre-adsorbent conditions

表3(續(xù))

煙熏鱘魚片的揮發(fā)性風味物質主要為酚類、醛類、酮類、醇類、酸類等化合物，酚類為煙熏食品的主要香味成分，具有抗氧化和防止腐敗的作用[20]。由表3 可知，間甲酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2，6-二甲氧基苯酚是煙熏鱘魚片的主要酚類物質。不同酚類賦予了煙熏食品多種多樣的口感，如苯酚具有酚香，類似煙熏的香氣，4-乙基創(chuàng)愈木酚具有香辛料和草藥香氣[21]。煙熏鱘魚片中酚類化合物種類較豐富，相對含量占比47.69%。添加前置吸附材料后，煙熏鱘魚片中的酚類物質發(fā)生了明顯變化，以棉花作為固相吸附劑時變化最明顯，幾乎截留了熏煙中所有的酚類物質；活性氧化鋁和分子篩作為固相吸附劑能吸附部分酚類化合物，使篩濾后的煙熏鱘魚片中酚類化合物相對含量分別為32.10%和46.55%；硅膠作為固相吸附劑表現(xiàn)相對較優(yōu)，檢出的酚類化合物高達13 種，占比53.38%。醛類是酯類氧化分解的主要產物，其閾值雖大，但對風味也有促進作用[22-23]。未添加前置固相吸附劑時，煙熏鱘魚片中檢出3 種醛類，占比5.25%；添加前置固相吸附劑(棉花、活性氧化鋁、分子篩、硅膠)后，煙熏鱘魚片中檢出的醛類種類分別為3 種、2 種、和2 種，其含量分別為2.75%、2.67%、3.57%、2.62%，差別較小，其中壬醛、糠醛是煙熏鱘魚片的主要醛類風味物質。未添加前置固相吸附劑時，煙熏鱘魚片中檢出2 種酮類，占比1.63%，添加前置固相吸附劑后酮類化合物的相對含量反而有所上升。

2.4 響應面煙熏工藝的優(yōu)化

上述研究結果表明，前置硅膠材料在有效降低熏煙鱘魚片中BaP 含量的同時可較好地保留酚類、醛類等風味化合物，因此選定硅膠為固相吸附材料進一步優(yōu)化煙熏工藝。

2.4.1 單因素試驗分析 由圖3 可知，在硅膠20 g和煙熏時間30 min 的條件下，隨著煙熏溫度的升高，煙熏鱘魚片中BaP 含量增加，煙熏溫度為80 ～85℃時，BaP 含量基本無變化，煙熏溫度為85 ～100℃時，BaP 含量變化較快，這可能是高溫使得魚肉中的物質發(fā)生反應，故本試驗選擇85℃作為煙熏溫度。

圖3 煙熏溫度對煙熏鱘魚片中BaP 含量的影響Fig.3 Effect of smoking temperature on BaP content of smoked sturgeon fillets

由圖4 可知，在硅膠20 g 和煙熏溫度85℃條件下調節(jié)煙熏時間為20 ～30 min 時，煙熏鱘魚片中的BaP含量幾乎不變；煙熏時間為30～40 min 時，BaP 含量呈上升趨勢。時間的長短會影響B(tài)aP 和風味物質的含量，因此本試驗煙熏時間選取30 min。

由圖5 可知，在煙熏時間30 min 和煙熏溫度85℃時，不同硅膠含量對煙熏鱘魚片BaP 含量的影響較大。隨著硅膠含量的增加，煙熏鱘魚片BaP 含量逐漸減少，當硅膠含量為10～20 g 時，煙熏鱘魚片BaP 含量變化趨勢較明顯；當硅膠含量為20 ～30 g 時，BaP 含量變化相對較平緩。本試驗還發(fā)現(xiàn)，隨著硅膠含量的增加，BaP含量在減少的同時，揮發(fā)性風味物質的含量也同時減少，本試驗選擇20～25 g 作為硅膠吸附劑的含量范圍。

圖4 煙熏時間對煙熏鱘魚片中BaP 含量的影響Fig.4 Effect of smoking time on BaP content of smoked sturgeon fillets

圖5 硅膠含量對煙熏鱘魚片中BaP 含量的影響Fig.5 Effect of silica gel content on BaP content of smoked sturgeon fillets

2.4.2 響應面優(yōu)化試驗設計與結果分析 通過Design-Expert 軟件進行二次響應面回歸分析，響應面試驗方案和結果見表4，并得到多元二次響應面回歸模型:Y=3.50-0.52X1＋0.19X2-0.86X3-0.28X1X2-0.13X1X3＋0.050X2X3＋0.60X12＋0.62X22＋0.58X32。

由表5 可知，模型的F值為9.46，P＜0.05，表明該模型可以用于模擬實際。3 個影響因素中，硅膠含量(X1)和煙熏溫度(X3)的影響顯著(P＜0.05)，3 個交互項的影響不顯著，二次項X12、X22、X32 影響顯著，說明BaP 含量主要受硅膠含量和煙熏溫度的影響。校正決定系數(shù)=0.826，表明該試驗中BaP 含量有82.6%的可能性都包含了回歸方程模型的9 個因子中，說明模型合適。R2=0.924，說明本試驗中BaP 含量的實際值與模型的預測值有較好的擬合度。變異系數(shù)CV=4.29%，CV 值低表示該試驗準確，可靠性高。

表4 響應面實驗方案及結果Table 4 Experimental scheme and results of response surface methodology

表5 回歸模型方差分析表Table 5 Variance analysis table of regression model

2.4.3 響應面分析 由圖6 可知，煙熏時間與硅膠含量、煙熏溫度與煙熏時間的交互作用對煙熏鱘魚片中BaP 含量的影響較弱，而煙熏溫度與硅膠含量的交互作用對BaP 含量影響較大。與煙熏溫度相比，硅膠含量所對應的曲面坡度更大，說明硅膠含量的變化對BaP 含量的影響較明顯，隨著硅膠含量的增加，鱘魚片中BaP 含量有所下降，這是因為隨著硅膠含量增加，BaP 的吸附量也隨之增加。煙熏溫度與煙熏時間所對應的曲面坡度較平，說明煙熏溫度在80℃以上與煙熏時間在20 min 以上時，對BaP 含量影響不大。此外，硅膠含量與煙熏時間的交互作用對BaP 含量的影響較弱。與煙熏時間相比，硅膠含量所對應的曲面坡度較陡，表明硅膠含量對BaP 含量的影響顯著。

圖6 兩因素交互作用對煙熏鱘魚片中BaP 含量的影響Fig.6 Effect of interaction of two factors on BaP content of smoked sturgeon fillets

2.4.4 最優(yōu)條件的確定及驗證 利用Design-Expert軟件對響應面試驗結果進行分析，得到降低BaP 含量的最優(yōu)工藝條件:硅膠含量23.5 g，煙熏時間29.6 min，煙熏溫度82.9℃，此條件下煙熏鱘魚片中BaP 含量為3.78 μg·kg-1。為方便試驗操作，將最優(yōu)條件調整為硅膠25 g，煙熏時間30 min，煙熏溫度85℃，以此條件制備煙熏鱘魚片，判定優(yōu)化工藝額的準確性，最終測得鱘魚片中的BaP 含量為3.89 μg·kg-1，與預測值相接近。

3 討論

煙熏食品過程中所產生的BaP 等多環(huán)芳烴具有強致癌性，嚴重影響食用安全性，使消費者對煙熏食品產生忌諱。本研究通過前置在線篩濾裝置，比較不同固相吸附材料(棉花、硅膠、分子篩、活性氧化鋁)條件下，煙熏鱘魚片中的BaP 含量。結果表明，幾種固相吸附材料均能吸附一定量的BaP，其中分子篩的吸附效果最佳，其次分別為活性氧化鋁、硅膠和棉花。該試驗結果與溫青青等[24]的研究結果相似。

本試驗相比周紅雷等[25]對鯧魚煙熏工藝的優(yōu)化，除了對比口感外，還對比分析了風味物質的含量。檢出的揮發(fā)性化合物主要包括酚類、醇類、酮類、碳氫化合物、酸類、酯類、酮類等，其中酚類物質是煙熏食品中的特色揮發(fā)性化合物，添加前置吸附材料硅膠后，主要的芳香性酚類均有所保留。

感官評分包括色澤、回味、質地、煙熏味、異味等幾類評價條件。本研究結果表明，不同前置吸附劑條件下，煙熏鱘魚片的感官評分差距較大，其中硅膠吸附劑的感官評分較高且與未添加吸附劑相近，而棉花、分子篩、活性氧化鋁吸附劑感官評分較低。后者大量截留了風味物質(酚類、醛類、酮類等)，導致感官評分較低。酚類是煙熏鱘魚片的主要風味物質，除了能產生令人回味的滋味外，還能抑制細菌生長。許雪萍等[26]研究發(fā)現(xiàn)醛類物質是煙熏肉的主要揮發(fā)性風味物質，其中壬醛具有清香味道，醛類物質的產生來自不飽和脂肪酸。煙熏加工過程中產生的酮類物質主要來源于美拉德反應[27]，或脂肪的氧化[28]，煙熏階段酮類作為中間產物通過氧化進一步分解形成其他產物[29]。

本研究進一步采用單因素優(yōu)化硅膠含量、煙熏時間以及煙熏溫度，并通過響應面研究不同因素之間的交互關系，確定最佳工藝參數(shù)。結果表明，以硅膠為前置吸附材料可實現(xiàn)在線篩濾熏煙中的BaP，并有效保留芳香性風味化合物，進而提高煙熏食品的安全性和感官品質。綜上所述，本研究結果對開發(fā)新型健康的煙熏食品具有重要參考意義，后續(xù)有待進一步研究硅膠的重復利用性能和高效復合硅膠的開發(fā)。

4 結論

本研究建立了以硅膠為固相吸附材料在線篩濾熏煙中BaP 的技術，并制備了煙熏即食魚片法。從感官評價、BaP 含量、風味物質的種類和含量等方面比較不同前置固相吸附材料對煙熏鱘魚片的影響及工藝優(yōu)化，結果表明，在硅膠含量25 g，煙熏時間30 min，煙熏溫度85℃條件下使用前置硅膠吸附劑的煙熏魚片感官評價最高，BaP 含量為3.89 μg·kg-1，揮發(fā)性風味成分中酚類物質含量最高(53.38%)。本研究采用的前置固相吸附劑對煙熏魚片的開發(fā)具有重要意義。