鄧源喜 許 暉 王家良 陳 佳

(蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

油桃富含糖分、維生素、纖維、胡蘿卜素和多酚等營養(yǎng)元素[1]，且色鮮味美、光潔無毛，深受人們喜愛，但其皮薄肉軟，組織含水量高，在采后運(yùn)輸和貯藏過程中易受到機(jī)械損傷而導(dǎo)致微生物侵染發(fā)生腐爛[2]。我國是油桃的主要生產(chǎn)國，年產(chǎn)量已超過1 200 萬t。由于采后病害和衰老過程，油桃品質(zhì)會隨著果實(shí)采后運(yùn)輸和貯藏過程而降低[3]。長期以來，油桃采后病害主要通過使用化學(xué)防腐劑來進(jìn)行控制，如咪鮮胺、多菌靈、噻菌靈和苯菌靈等[4]。然而，連續(xù)大量使用化學(xué)藥劑會導(dǎo)致侵染果實(shí)的病原菌抗性增強(qiáng)，同時對環(huán)境安全和人類健康具有潛在威脅。隨著消費(fèi)者對高品質(zhì)水果的需求不斷增加，開發(fā)新型、安全、高效的油桃生物保鮮劑產(chǎn)品顯得尤為重要。

植物精油是植物體內(nèi)的次生代謝物，具有抑菌和保持果蔬品質(zhì)等作用，已成為果蔬保鮮應(yīng)用中的熱點(diǎn)[5]。精油的化學(xué)組成復(fù)雜，其醛類、酚類和酮類化合物對病原菌的生長具有明顯的抑制作用，而且不易引起病原菌的抗性，符合果蔬采后保鮮綠色包裝的新趨勢[6-7]。百里香精油主要由百里香酚和香芹酚組成[8]，這類物質(zhì)對多種采后病原菌都表現(xiàn)出較高的抑制性，如指狀青霉菌[9]和膠孢炭疽菌[10]。薄荷精油也含有這2 種抗菌活性成分，而且具有較強(qiáng)的抗氧化活性[11]。此外，采用精油熏蒸處理果蔬，不僅能有效控制曲霉、青霉、毛霉和木霉菌等病原菌，而且能避免直接接觸果蔬，減輕對植物的藥害以及對感官品質(zhì)的影響[12]。

國內(nèi)采用精油熏蒸處理果蔬時，多將精油滴于濾紙片上，然后與果實(shí)一起封入儲藏盒內(nèi)[13]。但該方法不能保持盒內(nèi)空氣中精油組分含量，精油濃度較低時無明顯的保鮮效果，精油濃度較高時則易產(chǎn)生藥害[14]。本研究選用具有廣譜抗菌性能的百里香精油和薄荷精油[15]，采用瓊脂平板固封不同濃度的百里香精油和薄荷精油熏蒸處理油桃，分析冷藏過程中盒內(nèi)空氣成分，考察冷藏和模擬貨架期內(nèi)油桃的品質(zhì)參數(shù)，同時對褐腐病菌和灰葡萄球菌的抑菌活性進(jìn)行評價(jià)，以期為固封植物精油在果蔬保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

供試油桃品種為瑞光7 號，采自北京某農(nóng)業(yè)果園，選擇成熟度一致，平均單果重量為145 g 的八成熟果實(shí)，采后24 h 運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。挑選無病蟲害、無機(jī)械損傷、大小均一的果實(shí)用于試驗(yàn)。褐腐病菌(Monilinia fructicola)和灰葡萄球菌(Botrytis cinerea)在早期試驗(yàn)中從腐敗的油桃果實(shí)中分離純化獲得，使用前于新鮮的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化7 d。

百里香精油、薄荷精油，純品，湖南長沙格綠生物科技有限公司。無水乙醇、甲醇、石油醚、乙腈、正己烷，均為HPLC 級，德國Merck 公司。偏磷酸、無水硫酸鈉、抗壞血酸、氫氧化鉀，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Agilent 7890B-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、 Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；GY-4 型硬度計(jì)，浙江艾德堡儀器有限公司；405220 手持折光儀，成都泰華光學(xué)有限公司；AR2130 型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；IKA T25 型組織勻漿機(jī)、IKA Vortex GENIUS 3 型渦旋振蕩器，德國IKA 公司；DKZ-2B 型電熱恒溫水浴震蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；N-EVAP 型12 管氮吹儀，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；3K15 臺式高速離心機(jī)，德國SIGMA 公司；100 μm PDMS 固相萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 將10.0 mL 純精油與88.0 mL 無菌水混合后，加入2 mL 吐溫20，搖勻，加入1.5 g 瓊脂，攪拌均勻后得到10%精油濃度。同理獲得1%精油濃度。將5.0 mL 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，瓊脂固化后，制成精油香膏，現(xiàn)配現(xiàn)用。每70 個油桃為一組，放入透明儲藏盒(84 cm×54 cm×30 cm)內(nèi)，每個儲藏盒內(nèi)放5 個精油香膏。油桃在溫度0℃和相對濕度98%條件下貯藏28 d，期間分別用1%百里香精油、10%百里香精油、1%薄荷精油和10%薄荷精油香膏熏蒸，以不加精油香膏作為對照，熏蒸結(jié)束后，模擬貨架銷售，在25℃條件下貯藏5 d。

1.3.2 貯藏過程中儲藏盒內(nèi)精油成分分析 用正己烷將百里香精油和薄荷精油稀釋至10 μL·L-1，以50∶1 的分流比直接進(jìn)樣，取7.5 ～40 min 的流出組分，通過相對峰面積計(jì)算各樣品中各組分的相對百分含量，確定2 種精油的主要揮發(fā)性成分，每次分析3 個平行樣品。貯藏條件下，采用100 μm PDMS 固相微萃取裝置在儲藏盒內(nèi)萃取15 min，用GC-MS 不分流進(jìn)樣分析，研究貯藏過程中精油揮發(fā)性成分的變化，分別在第1、第14 和第28 天進(jìn)行固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(solid phase microextraction coupled with gas chromatography and mass spectrometry，SPME-GCMS)分析，每次分析3 個平行樣品。

儀器條件:色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，色譜柱初溫50℃、保持3 min，5℃·min-1升溫至70℃、保持5 min，1℃·min-1升溫至90℃，5℃·min-1升溫至150℃，25℃·min-1升溫至250℃、保持2 min，恒定氦氣流量1.0 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度250℃，離子源溫度230℃，傳輸線200℃，Scan 模式，電子能量70 eV。

1.3.3 抑菌能力 褐腐病菌和灰葡萄球菌在使用前于4℃用瓊脂斜面保存?；移咸亚蚓隈R鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，獲得孢子懸浮液。褐腐病菌在番茄瓊脂培養(yǎng)基(250 mL 番茄汁、750 mL 無菌水、20 g 瓊脂)培養(yǎng)5 d 后，向平皿中加入5 mL 無菌水，用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子，再用雙層紗布過濾，獲得褐腐病菌分生孢子懸浮液。用平板計(jì)數(shù)法算出孢子懸浮液濃度后稀釋至約104CFU·mL-1。取100 μL 孢子懸浮液均勻涂抹在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，與4 種精油香膏一同放入紫外滅菌后的儲藏盒內(nèi)進(jìn)行熏蒸處理，同時做對照試驗(yàn)。在20 和36 h 時分別計(jì)數(shù)灰葡萄球菌和褐腐病菌的孢子萌芽情況，當(dāng)芽管超過分生孢子長度時，認(rèn)為孢子萌發(fā)。每次設(shè)置3 個平行試驗(yàn)，考察固封不同濃度百里香精油和薄荷精油熏蒸對灰葡萄球菌和褐腐病菌的抑菌能力，用孢子萌芽率反映其抑菌能力:

1.3.4 腐爛指數(shù) 參考潘磊慶等[16]的方法，于33 d貯藏結(jié)束后統(tǒng)計(jì)不同處理下油桃的腐爛指數(shù):

式中，腐爛等級按腐爛面積占果實(shí)表面積的百分比劃分: 0 級，無腐爛；1 級，(0，25%]； 2 級，(25%，50%]；3 級，(50%，75%]；4 級(75%，100%]。

1.3.5 失重率和硬度 在試驗(yàn)開始前對每個處理的30 個油桃進(jìn)行稱重，記錄初始重量，然后于貯藏7、14、21、28 和33 d 分別稱重，按照公式計(jì)算失重率:

參考《NY/T 2009-2011 水果硬度的測定》[17]在貯藏0、7、14、21、28、33 d 分別測定油桃硬度。

1.3.6 β-胡蘿卜素、抗壞血酸、可溶性固形物和可滴定酸的測定 參考GB 5009.83-2016[18]測定油桃中β-胡蘿卜素的含量。樣品中的β-胡蘿卜素經(jīng)皂化后，用石油醚萃取、二氯甲烷定容后，用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法定量測定。

參考GB 5009.86-2016[19]測定油桃中抗壞血酸的含量。樣品勻漿后，用偏磷酸溶解、超聲提取，離子對試劑作為流動相，用HPLC 法定量測定。

參考NY/T 2637-2014[20]，用折射儀測定油桃可溶性固形物含量。

參考張倩等[21]的方法，采用氫氧化鈉滴定法測定可滴定酸含量。分別在貯藏0、14、28、33 d 時測定上述4 個指標(biāo)。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Word 2016 完成圖表繪制，Microsoft Excel 2016 完成數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過程中精油揮發(fā)性成分的變化

采用直接進(jìn)樣法測定精油的揮發(fā)性組分，結(jié)果如表1 所示，百里香精油的主要揮發(fā)性成分是百里香酚，占26.02%，其次是對傘花烴、α-松油醇和芳樟醇如表1 所示。用百里香精油香膏熏蒸后，于熏蒸1、14 和28 d 時對儲藏盒內(nèi)的空氣組分進(jìn)行SPME-GCMS 分析。結(jié)果表明，在28 d 貯藏過程中，對傘花烴是最主要的揮發(fā)性成分，與精油直接進(jìn)樣相比，芳樟醇的相對含量也有顯著提升(P＜0.05)。相反，作為主要抑菌成分的百里香酚[22]其相對含量卻顯著降低(P＜0.05)，用10%百里香精油熏蒸1、14 和28 d 時，其相對含量分別為0.60%、2.78%和2.67%，用1%百里香精油熏蒸時，其相對含量分別為0.40%、3.66%和3.67%。這可能是因?yàn)橹苯舆M(jìn)樣時采用正己烷直接稀釋精油，可完全溶解精油的所有組分，而PDMS 固相萃取對精油成分的吸附是一個動態(tài)平衡的過程。貯藏過程中，2 種濃度處理下的百里香酚含量均隨貯藏時間延長有所增加，最后趨于平衡，說明固封精油熏蒸具有穩(wěn)定性。

薄荷香精油的直接進(jìn)樣分析結(jié)果見表2，其主要成分是芳樟醇，占22.16%，其次是香芹酚(13.29%)、百里香酚(10.67%)和對傘花烴(10.63%)。在貯藏過程中，芳樟醇和桉油精是儲藏盒內(nèi)主要的揮發(fā)性成分，二者的相對含量之和在各貯藏階段均占40%以上。與百里香精油類似，作為主要抑菌功能成分的百里香酚和香芹酚的相對含量與直接進(jìn)樣相比顯著降低(P＜0.05)，但其相對含量在貯藏過程中緩慢增加。

表1 百里香精油熏蒸貯藏過程中盒內(nèi)揮發(fā)性成分分析Table 1 Thyme essential oil composition and volatilized compounds analysis in box during fumigation /%

圖1 不同熏蒸處理對褐腐病菌和灰葡萄球菌的抑制作用Fig.1 M.fructicola and B.cinerea conidial germination percentage with different essential oils fumigation in vitro

表2 薄荷精油熏蒸貯藏過程中盒內(nèi)揮發(fā)性成分分析Table 2 Savory essential oil composition and volatilized compounds analysis in box during fumigation /%

2.2 不同熏蒸處理對2 種病原菌的抑制作用

在4 種熏蒸處理下培養(yǎng)褐腐病菌和灰葡萄球菌，其孢子萌發(fā)結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，精油揮發(fā)性成分有明顯的抑菌活性，其抑菌效果取決于精油的種類、濃度和病菌種類。與對照組相比，10%薄荷精油熏蒸幾乎能完全抑制褐腐病菌的萌芽，1%和10%濃度的百里香精油能將褐腐病菌的萌芽率分別降低35.4 和49.1個百分點(diǎn)。此外，當(dāng)精油濃度增加時，抑菌能力均明顯提高。

2.3 精油熏蒸處理對油桃腐爛指數(shù)的影響

由圖2 可知，精油熏蒸處理能夠明顯減少油桃的腐爛。在0℃冷藏期間，5 種處理下的油桃均未發(fā)生腐爛，而在25℃貯藏5 d 后，對照組腐爛指數(shù)為23.3%，從腐爛果實(shí)中分離出的病原菌經(jīng)生物鑒定，確認(rèn)由褐腐病菌和灰葡萄球菌引起的腐爛指數(shù)分別為10.7%和8.0%，此外，還有4.9%的腐爛由鏈格孢菌引起。精油熏蒸處理后腐爛指數(shù)均有不同程度的降低，其中10%薄荷精油熏蒸效果最好，腐爛指數(shù)只有4%，這與體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果相符。對照組中，褐腐病菌引起的腐爛占腐爛油桃的45.9%，說明褐腐病菌是油桃自然貯藏的主要致病菌，經(jīng)過1%和10%百里香精油熏蒸后，褐腐病引起的腐爛指數(shù)降低到3.3%和2.5%，相對發(fā)病率為45.2%和26.9%，但是灰霉病引起的腐爛指數(shù)仍有4%和6.8%，相對發(fā)病率從34.3%升至54.7%和73.1%，說明灰葡萄球菌對2 種精油均不敏感。

2.4 精油熏蒸處理對油桃失重率和硬度的影響

采后果實(shí)的呼吸作用和蒸騰作用會導(dǎo)致其失水失重，影響果實(shí)硬度。由圖3-A 可知，在整個貯藏期間，對照組和精油熏蒸處理組油桃的失重率均呈持續(xù)上升趨勢，在28 d 冷藏結(jié)束后，對照組與1%百里香精油和1%薄荷精油組差異顯著(P＜0.05)，與10%百里香精油組差異極顯著(P＜0.01)。25℃模擬貨架期(28 ～33 d)時，果實(shí)失重率明顯上升，且對照組顯著高于精油熏蒸處理組(P＜0.05)。由圖3-B 可知，在整個貯藏期間，果實(shí)硬度呈持續(xù)下降趨勢，對照組與精油熏蒸處理組之間無顯著差異(P＞0.05)。但在25℃模擬貨架期(28～33 d)時，果實(shí)硬度明顯降低，對照組硬度最低。說明精油熏蒸能有效防止油桃水分散失，降低果實(shí)失重率，但對果實(shí)硬度的影響不顯著，這可能是油桃品種本身品質(zhì)的原因。

圖3 精油熏蒸處理對油桃果實(shí)失重率(A)和硬度(B)的影響Fig.3 Effects of essential oil treatment on weight loss rate (A) and firmness (B) of nectarine fruits

2.5 精油熏蒸處理對油桃β-胡蘿卜素、抗壞血酸含量、可溶性固形物和可滴定酸的影響

通常情況下，類胡蘿卜素因受光照和空氣的影響而逐漸減少。由圖4-A 可知，在冷藏期內(nèi)，油桃果實(shí)β-胡蘿卜素含量整體呈下降趨勢，精油熏蒸處理組與對照組無顯著差異(P＞0.05)，25℃貯藏階段，果實(shí)β-胡蘿卜素含量下降速度明顯增加，且對照組的下降速度比精油熏蒸處理組明顯增加，精油熏蒸處理組果實(shí)β-胡蘿卜素含量整體保持穩(wěn)定，且各處理間無顯著差異(P＞0.05)。試驗(yàn)結(jié)束時，1%和10%百里香精油熏蒸油桃的β-胡蘿卜素平均含量最高，分別為105 μg·100g-1和102 μg·100g-1?？箟难嵬瑯诱w呈持續(xù)下降趨勢(圖3-B)，雖然精油熏蒸處理能夠降低抗壞血酸的損失，但在33 d 貯藏期結(jié)束時，精油熏蒸處理組與對照組間無顯著差異(P＞0.05)，且果實(shí)抗壞血酸比β-胡蘿卜素?fù)p失更大。

圖4 精油熏蒸處理對油桃果實(shí)β-胡蘿卜素(A)和抗壞血酸(B)含量的影響Fig.4 Effects of essential oil treatment on β-carotenoids (A) and ascorbic acid (B) of nectarine fruits

可溶性固形物和可滴定酸可以反映油桃營養(yǎng)物質(zhì)的消耗速度和程度，是衡量保鮮效果的重要指標(biāo)。由圖5 可知，在整個貯藏期間，精油熏蒸處理組果實(shí)的可溶性固形物和可滴定酸含量均與對照組差異不顯著(P＞0.05)，表明精油熏蒸對二者的影響較小。對照組和精油熏蒸處理組的可溶性固形物和可滴定酸含量整體保持一致?？扇苄怨绦挝锖吭谫A藏28 d 時略微上升，后期25℃貯藏階段降低。這可能是因?yàn)樵谫A藏初期淀粉、果膠、粗纖維等水解產(chǎn)物增加，表現(xiàn)為可溶性固形物含量升高，模擬貨架時溫度升高，呼吸作用加強(qiáng)，可溶性固形物被消耗[6，23]?？傻味ㄋ岷吭谡麄€貯藏期間均呈緩慢下降的趨勢。

3 討論

百里香酚和香芹酚是精油的主要抗菌活性成分，SPME-GCMS 分析結(jié)果表明，精油熏蒸貯藏過程中儲藏盒內(nèi)二者的相對含量均緩慢增加，最后趨于平衡，說明采用瓊脂平板固封精油能讓精油緩慢釋放，并持續(xù)維持盒內(nèi)空氣抑菌組分的相對含量。此外，即使空氣中百里香酚和香芹酚的濃度很低，也能有效抑制褐腐病菌的萌芽生長，這與王京法等[24]的體外抗菌結(jié)果一致。本研究結(jié)果還表明，當(dāng)精油濃度增加時，其抑菌活性明顯提高，這與Svircev 等[25]的研究結(jié)果相符。值得注意的是，百里香精油和薄荷精油可以有效抑制褐腐病菌的生長，10%薄荷精油甚至基本能完全抑制褐腐病菌的萌芽，但在本研究中灰葡萄球菌對2 種精油的敏感性均較低，導(dǎo)致精油、熏蒸處理中灰霉病成為油桃腐爛的主要病菌[26]。Arrebola 等[27]也曾發(fā)現(xiàn)這2種精油對油桃灰葡萄球菌的抑菌活性不強(qiáng)，但施俊鳳等[28]和王建清[29]研究百里香精油對番茄和冬瓜中灰葡萄球菌的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，灰葡萄球菌對百里香精油很敏感，這種差異可能是由試驗(yàn)對象和精油濃度不同引起的。

使用固封精油熏蒸油桃后，能夠很好地保持果實(shí)的硬度，降低果實(shí)失重率，這是因?yàn)榫驼羝谟吞冶砻嫘纬傻耐繉涌梢愿淖儦怏w滲透，降低呼吸作用和水分損失[30]。有研究表明，用精油熏蒸櫻桃[31]、葡萄[32]和桃子[33]時，也能降低果實(shí)的失重率。

圖5 精油熏蒸處理對油桃果實(shí)可溶性固形物(A)和可滴定酸(B)含量的影響Fig.5 Effects of essential oil treatment on soluble solid content (A) and titratable acid (B) of nectarine fruits

固封精油熏蒸能減少β-胡蘿卜素和抗壞血酸的損失，這是因?yàn)橹参锞途哂锌寡趸钚院妥杂苫宄芰34]。Valero 等[35]發(fā)現(xiàn)百里香精油結(jié)合氣調(diào)保鮮能減少葡萄抗壞血酸的損失。張有林等[36]也發(fā)現(xiàn)百里香精油的抗氧化和自由基清除能力隨濃度的增加而增強(qiáng)。這些研究均表明精油熏蒸能減少果實(shí)營養(yǎng)物質(zhì)的損失。但抗壞血酸和脫氫抗壞血酸是植物體內(nèi)重要的抗氧化活性成分[37]，它們的化學(xué)性質(zhì)和代謝功能決定了這類物質(zhì)在貯藏過程中比β-胡蘿卜素更容易損失[38]，這與本研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，用瓊脂平板固封百里香精油和薄荷精油，可使精油在儲藏盒內(nèi)緩慢釋放，并在較長時間內(nèi)維持儲藏盒內(nèi)精油功能成分的濃度，有效抑制褐腐病菌的生長，減少油桃的腐爛，延緩后熟衰老，較好地保持果實(shí)的失重率和硬度。但灰葡萄球菌對這2 種精油揮發(fā)性成分的敏感性較低，在褐腐病菌被抑制的情況下，導(dǎo)致精油熏蒸處理中灰葡萄球菌成為主要致病菌，引起灰霉病。另外，精油熏蒸能夠減少抗壞血酸和類胡蘿卜素的氧化，但對果實(shí)的可溶性固形物和可滴定酸含量無明顯影響。綜上，精油香膏熏蒸可以作為油桃采后保鮮的有效手段，具有較大的商品化應(yīng)用潛力。