徐 赫 梁成偉 陳明娜 陳 娜 王 通 袁 美 潘麗娟 遲曉元

(1山東省花生研究所，山東 青島 266100；2青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042)

我國(guó)花生的種植面積全球排名第二位，產(chǎn)量排名第一位[1-4]。我國(guó)生產(chǎn)的花生中約一半用于壓榨花生油，花生油的總產(chǎn)量約占國(guó)內(nèi)食用植物油總量的25%。隨著食用油需求量的不斷增加，花生在保障我國(guó)食用植物油的供給上具有巨大的潛力和優(yōu)勢(shì)[5]。研究花生油脂合成的生理機(jī)制，提高花生種子的含油量[5-6]是主要的研究方向。

三酰甘油(triacylglycerols，TAG)是植物油脂儲(chǔ)存的主要方式。脂磷酸磷酸酶( lipid phosphate phosphatase，LPP)可催化磷脂酸脫磷酸生成二酰甘油(diacylglycerols，DAG)[7]，DAG 參與TAG 合成途徑。因此，LPP 對(duì)提高植物油含量具有重要作用。

磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid phosphatase，PAP是一類重要的去磷酸酶，能夠?qū)⒌孜锪字?phosphatidic acid，PA)去磷酸化[8]。它可分為兩種類型，第一類酶(PAP1)的作用依賴于Mg2＋，可被乙基馬來(lái)酰亞胺所抑制，是一類可溶解的酶，對(duì)底物有高度專一性[9]。第二類酶(PAP2 或LPP)的作用不依賴于Mg2＋，通常對(duì)N-乙基馬來(lái)酰亞胺(N-ethylmaleimide，NEM)不敏感，其作用底物比較廣泛，可水解一系列含有單酯鍵的脂磷酸物質(zhì)，并定位于質(zhì)膜上，一般具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[10]。研究表明PAP1 和PAP2 在分子結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)性質(zhì)及其調(diào)控的機(jī)制等方面有很大不同，分別屬于不同的家族[11]。

LPP 在甘油脂的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，LPP 既可以催化PA去磷酸化生成DAG，也可使二脂酰甘油焦磷酸(diacylglycerolpyrophosphate，DGPP)生成PA[12]。PA 和DAG 是脂代謝過(guò)程中的中間產(chǎn)物和信號(hào)分子[9，13]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了9 個(gè)LPP基因，其中原核型LPP基因有5 個(gè)，AtLPPβ、AtLPPγ、AtLPPδ、AtLPPε1、AtLPPε2[14]；真核型LPP基因有4 個(gè)，AtLPP1、AtLPP2、AtLPP3、AtLPP4[13]。其中3 個(gè)原核型AtLPPγ、AtLPPε1、AtLPPε2基因定位于葉綠體，具有LPP 活性，活性受Mg2＋抑制。它們?cè)诰G色和非綠色組織中的表達(dá)有所不同。AtLPPγ在莖、花中表達(dá)量比其他2 個(gè)基因高。這3 個(gè)原核型LPP基因在葉和根中都有表達(dá)，但是表達(dá)量不同。AtLPPγ缺失導(dǎo)致植物死亡，說(shuō)明AtLPPr可能是最初的質(zhì)體型LPP基因[14-15]。擬南芥真核型LPP1、LPP2、LPP3 和LPP4 蛋白與哺乳動(dòng)物、酵母和果蠅LPP 蛋白具有同源性[9]。AtLPP1 和AtLPP2 在各個(gè)組織中均有表達(dá)，包括葉片、莖、根和花等[12-13]。AtLPP1 基因受γ射線、UV-B、黃蜂毒素和細(xì)菌蛋白的誘導(dǎo)，AtLPP2 基本不受各種脅迫影響[13]。AtLPP2 響應(yīng)脫落酸(abscisic acid，ABA)信號(hào)，在種子萌發(fā)及葉片氣孔運(yùn)動(dòng)中的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[7]。AtLPP3 在種子萌發(fā)期基因表達(dá)增強(qiáng)，在葉片中的表達(dá)受ABA 刺激而顯著升高，原核表達(dá)不能檢測(cè)到其活性。AtLPP4 酶活性和功能都沒(méi)有被報(bào)道[16]。

表1 花生LPP 全長(zhǎng)擴(kuò)增用引物的序列Table 1 The primers of full-length LPPs genes

本研究從花生中分離8 個(gè)AhLPP基因，AhLPP1、AhLPP2、AhLPP4、AhLPPβ1、AhLPPβ2、AhLPPγ、AhLPPδ和AhLPPε，登錄號(hào)分別為KP109933、 JN032678、KP109934、KP109935、KP109936、KP109937、KP109938、KP109939。并對(duì)LPP 基因家族進(jìn)行理化性質(zhì)、同源性以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR)分析這些基因在5 類激素與4 種非生物脅迫下的表達(dá)情況，以期了解LPP 基因家族的表達(dá)特性，為研究花生油脂合成和抗逆調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇遺傳育種實(shí)驗(yàn)室培育的花育33 號(hào)花生品種為試驗(yàn)材料。

1.2 不同組織、不同種子發(fā)育時(shí)期和脅迫處理取樣方法

參照郝翠翠等[17]的方法進(jìn)行品種前處理，略有修改?；ㄉL(zhǎng)至三葉期時(shí)，分別采集根、莖、葉、子葉和下胚軸，在花生盛花期采集花生花?；ㄉ_(kāi)花下針后，采集其下針后12、24、36、48、和60 d 的種子。花生生長(zhǎng)至三葉期后進(jìn)行非生物脅迫處理試驗(yàn)。水楊酸(salicylic acid，SA，2 mmol·L-1)、過(guò)氧化氫(H2O2，10 mmol·L-1)均處理0、4、8、12、24、36、72 h，以清水作為對(duì)照；赤霉素(gibberellin，GA，100 μmol·L-1)處理0、4、8、12、24、72 h，以相同濃度乙醇作為對(duì)照；乙烯利(ethephon，ET，5 mmol·L-1)處理0、8、12、24、48、72 h，以清水作為對(duì)照；ABA(100 μmol·L-1)處理0、8、12、24、48、72 h，以相同濃度乙醇作為對(duì)照；茉莉酸(jasmonic acid，JA，100 μmol·L-1)處理0、8、12、24、48、72 h，以清水作為對(duì)照；鹽(NaCl 200 mmol·L-1)、冷(4℃)、干旱(15%聚乙二醇，PEG 6000)均處理0、4、8、12、24、72 h，以清水作為對(duì)照。除低溫處理外，應(yīng)先將花生三葉期幼苗從土中小心取出，清洗去除根部泥土，再置于相應(yīng)條件下進(jìn)行處理。除低溫、鹽和干旱處理外，其余處理還需要用溶液涂抹花生葉片。在處理的不同時(shí)間段分別取花生幼苗的葉片，放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因的擴(kuò)增

根據(jù)NCBI 上搜索到的LPP序列，從花生cDNA文庫(kù)中搜索到了可能的LPP序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)引物。設(shè)計(jì)的引物序列見(jiàn)表1。參照陳娜等[18-19]的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA 作模板，PCR 擴(kuò)增得到目的基因。

1.4 氨基酸序列分析

蛋白質(zhì)的基本參數(shù)采用ProtParam 分析；蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)采用SCRATCH Protein Predictor Tool 分析；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)采用TMHMM 2.0 Server 分析；蛋白質(zhì)的信號(hào)肽采用SignalP 3.0 Server 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位采用PSORT 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)；利用GSDS在線分析工具進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；蛋白的保守結(jié)構(gòu)域采用NCBI-CDS 在線分析。

1.5 多序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

為了更好地確定AhLPPs 蛋白的進(jìn)化關(guān)系，本研究利用已知的AhLPPs 基因家族的氨基酸序列在NCBI、 peanutbase ( https:/ /www.peanutbase.org/)、phytozome (https:/ /phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html＃)上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，搜索其他LPP 蛋白。采用ClustalW 軟件對(duì)搜索獲得的序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，采用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，利用鄰接法(neighbour-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 RT-qPCR 分析

RT-qPCR 反應(yīng)的方法和條件參照陳娜等[18-19]的方法。內(nèi)參基因?yàn)锳ctin11，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，采用2-△△Ct方法[20]分析數(shù)據(jù)。RT-qPCR 分析所用引物見(jiàn)表2。

表2 花生脂磷酸磷酸酶基因表達(dá)的引物序列Table 2 The sequences of RT-PCR primers of LPP genes

2 結(jié)果與分析

2.1 AhLPP 基因家族的克隆與序列分析

采用設(shè)計(jì)的基因引物，從花生葉片中克隆獲得8 個(gè)LPP基因(表3)，其編碼框(open reading frames，ORF)長(zhǎng)度分別為1 008、969、855、687、597、684、1 212、882 bp，分別編碼335、322、284、228、198、227、403 和293 個(gè)氨基酸。對(duì)8 個(gè)AhLPP 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。8 個(gè)AhLPP 蛋白所含的亮氨酸殘基的含量都比較高；帶負(fù)電的氨基酸殘基數(shù)為11～31 個(gè)，占氨基酸殘基總數(shù)的5.56%～10.20%；帶正電的氨基酸殘基數(shù)為15～32 個(gè)，占比為5.46%～9.55%。除了AhLPPδ 和AhLPPγ 外，其他6 個(gè)LPP基因編碼的蛋白都屬于不穩(wěn)定蛋白。對(duì)AhLPP 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(表5)，結(jié)果表明，AhLPP 含有α-螺旋85～140 個(gè)，占31.72%～51.10%；β-折疊9～31 個(gè)，占4.55%～10.67%；自由卷曲52～114 個(gè)，占22.91%～34.03%。

表3 AhLPP 基因的序列分析Table 3 The sequence analysis of AhLPP genes

表4 AhLPP 蛋白的理化性質(zhì)Table 4 Physicochemical properties of AhLPP proteins

對(duì)AhLPP 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(表5)，結(jié)果表明8 個(gè)AhLPP 蛋白有3～6 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，推測(cè)這8 個(gè)蛋白均屬于跨膜類蛋白。對(duì)AhLPP 蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明這8 個(gè)蛋白均無(wú)信號(hào)肽。PSORT 在線服務(wù)對(duì)AhLPP 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，推測(cè)LPPs 蛋白可能主要存在于質(zhì)膜上。

2.2 LPPs 蛋白同源性分析

將擬南芥(At)和克隆的花生(Ah)中的LPPs 蛋白家族氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析和多序列比對(duì)分析(圖1)。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)AhLPP 基因家族在靠近C 端處均含有一個(gè)第二類磷脂酸磷酸酶(PAP2)結(jié)構(gòu)域，即脂磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明這8 個(gè)基因有同源性，屬于同一個(gè)基因家族。AhLPP1、AhLPP2、AhLPP4、 AhLPPβ1、 AhLPPβ2、 AhLPPγ 和AhLPPδ 都含有一個(gè)可以結(jié)合磷脂的acid PPc 結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明這7 個(gè)基因在細(xì)胞內(nèi)的功能可能與磷脂有關(guān)。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，AhLPPδ 與AtLPPδ 序列相似性為66.5%；AhLPPγ 與AtLPPγ 序列相似性為61.4%；AhLPP1 與AtLPP1 序列相似性為57.5%；AhLPP2 與AtLPP2 序列相似性為63.9%；AhLPP4 與AtLPP4 序列相似性為59.5%；AhLPPβ1 與AtLPPβ 序列相似性為41.5%；AhLPPβ2 與AtLPPβ 序列相似性為36.5%；AhLPPβ1 與AhLPPβ2 相 似性為86.8%；AhLPPε 與AtLPPε1 序列相似性為39.3%。在序列比對(duì)圖中，黑色方框圈出的區(qū)域表示LPP 的3 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即KXXXXXXRP、PSGH、SRXXXXXHXXXD。這些結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域并存，可能形成一個(gè)重要的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)組成部分[13，21-22]。

2.3 AhLPP 基因結(jié)構(gòu)分析

對(duì)克隆的LPP基因使用GSDS 工具進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和剪接分析[18]，AhLPP1 有7 個(gè)內(nèi)含子和8 個(gè)外顯子。AhLPP2 含有6 個(gè)內(nèi)含子和7 個(gè)外顯子。AhLPP4 含有6 個(gè)內(nèi)含子和7 個(gè)外顯子。AhLPPβ1 顯示僅有外顯子，AhLPPβ2 有1 個(gè)內(nèi)含子和2 個(gè)外顯子?？梢?jiàn)，AhLPPβ1 和AhLPPβ2 基因長(zhǎng)度的變化是由于選擇性剪切造成的。AhLPPγ有1 個(gè)內(nèi)含子和2 個(gè)外顯子。AhLPPδ含有6 個(gè)內(nèi)含子和7 個(gè)外顯子。AhLPPε有3個(gè)內(nèi)含子和4 個(gè)外顯子。內(nèi)含子5′端剪接位點(diǎn)和3′端剪接位點(diǎn)的剪接方式符合經(jīng)典的GT-AG 規(guī)律[4]。

2.4 LPP 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

圖2 AhLPP 基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 The schematic diagrams of the AhLPP structures

將克隆的AhLPP 基因家族與擬南芥、野生種花生(Arachis duranensis，Ad；Arachis ipaensis，Ai)、栽培種花生(Arachis hypogaeaL，Ahy)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula，Mt)、木豆(Cajanus cajan，Cc)、小立碗蘚(Physcomitrella patens，Pp)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii，Cr)、杜氏鹽藻(Dunaliella salina，Ds)、團(tuán)藻(Volvox carteri，Vc)、細(xì)小微胞藻(Micromonas pusillaCCMP1545，Mp)、微單胞藻(Micromonassp.RCC299，Msp)以及鞭毛藻(Ostreococcus lucimarinus，Ol)等的LPPs 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)構(gòu)來(lái)看，LPPs 蛋白聚成了兩大分支。第一大分支包含真核型蛋白LPP 基因(LPP1、LPP2、LPP3、LPP4)，兩類原核型LPP 基因(LPPβ、LPPδ)；第二大分支只包含兩類原核型的LPP 基因(LPPε、LPPγ)。對(duì)于真核型的LPP 基因來(lái)說(shuō)，苔癬和藻類的LPP 基因位于分支的基部，可能是高等植物真核型LPP 基因的祖先。前人研究表明，LPPγ可能是最初的質(zhì)體型LPP基因[13-14]。本研究搜索上述6 個(gè)真核藻類的基因組發(fā)現(xiàn)，它們只有1 或2 個(gè)真核型LPP 基因和LPPγ 基因，不含有其他原核型的LPP 基因。因此，其他原核型LPP 基因可能由LPPγ 演變進(jìn)化而來(lái)。

圖3 AhLPP 與其他植物L(fēng)PP 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of LPPs in various species

2.5 AhLPP 基因的表達(dá)特性分析

通過(guò)RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)了7 個(gè)LPP基因在不同組織、不同種子發(fā)育時(shí)期、4 種非生物脅迫條件和5 種激素處理下的表達(dá)特性，如圖4 所示。AhLPP1 在花生根中表達(dá)量最高，其次為下胚軸和葉片。AhLPP2 和AhLPPβ在下胚軸和花中表達(dá)量較高，在其他組織中表達(dá)量較低。AhLPP4、AhLPPε和AhLPPδ在花生根中表達(dá)量最高。AhLPPγ在花生的根中表達(dá)量最高，在花和子葉中也有較高的表達(dá)量。在種子發(fā)育過(guò)程中(圖5)，AhLPP1、AhLPP2、AhLPPβ、AhLPPγ和AhLPPε基因均在種子發(fā)育初期表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量下降。AhLPP4 在發(fā)育初期表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量下降，在48 d 后表達(dá)量再次上升。AhLPPδ基因的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。

圖4 AhLPPs 基因在花生不同組織中的表達(dá)量分析Fig.4 Expression analysis of AhLPPs in different tissues

由圖6 可知，以0 h 花生三葉期幼苗為對(duì)照，除了SA 和PEG 6000 處理外，其他處理下花生葉片中AhLPP1 基因均明顯誘導(dǎo)表達(dá)。其中，低溫處理4 h 表達(dá)量最高，為對(duì)照的2.2 倍，之后與對(duì)照保持相似水平。NaCl 處理下，0 ～8 h 期間AhLPP1 表達(dá)量無(wú)明顯變化，12 h 表達(dá)量最高，為對(duì)照的9.6 倍，之后表達(dá)量大幅下降。H2O2、JA 和ABA 處理72 h 后AhLPP1 表達(dá)量最高，分別為對(duì)照的11.5、2.4 和2.8 倍。ET 處理48 h 時(shí)AhLPP1 表達(dá)量明顯上調(diào)，為對(duì)照的2.7 倍。GA 處理4 h 基因表達(dá)無(wú)變化，8 h 時(shí)表達(dá)量最高，12 h明顯下降，之后保持平穩(wěn)。如圖7 所示，AhLPP2 基因在激素和非生物脅迫處理下均明顯誘導(dǎo)表達(dá)。4℃、JA 和ET 處理24 h，AhLPP2 基因表達(dá)量明顯上調(diào)，分別為對(duì)照的5.0、7.5 和4.4 倍。NaCl、PEG 6000 和ABA 處理12 h 后，AhLPP2 表達(dá)量最高，為對(duì)照的34.3、3.5 和6.7 倍。H2O2和GA 處理72 h 后，AhLPP2 表達(dá)量最高，是對(duì)照的12.8 和7.3 倍。SA 處理4 h 基因表達(dá)量上調(diào)，8 h 達(dá)到最高，為對(duì)照的10倍，之后大幅下降，保持在較低水平。

圖5 AhLPPs 基因在花生種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量分析Fig.5 Expression analysis of AhLPPs at different stages of seed development

圖6 AhLPP1 基因在激素和非生物脅迫處理下的表達(dá)量分析Fig.6 Expression analysis of AhLPP1 under hormones and abiotic stresses

圖7 AhLPP2 基因在激素和非生物脅迫條件下的表達(dá)量分析Fig.7 Expression analysis of AhLPP2 under five hormones and four abiotic stresses

如圖8 所示，在4℃、JA、ABA 處理下，花生葉片中AhLPP4 基因表達(dá)量下調(diào)。PEG 6000 處理后，AhLPP4基因表達(dá)量無(wú)變化。NaCl 和ET 處理24 h 基因表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照的5.4 和3.2 倍。H2O2和SA 處理8 h 后，AhLPP4 表達(dá)量最高，為對(duì)照的2.1 和4.0倍。GA 處理4 h 基因表達(dá)量最高，為對(duì)照的3.6 倍，隨后表達(dá)量下降。如圖9 所示，除GA 處理外，AhLPPβ基因在8 種因素處理下均顯著誘導(dǎo)表達(dá)。低溫處理0～12 h 幾乎無(wú)變化，12 h 后逐漸上調(diào)，72 h 基因表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照的5 倍。AhLPPβ基因在NaCl、PEG 6000 和ABA 處理12 h 后表達(dá)量最高，分別為對(duì)照的17.2、3.2 和3.7 倍。H2O2和JA 處理24 h 基因表達(dá)量最高，為對(duì)照的21.5 和9.0 倍。SA 和ET 處理8 h 基因表達(dá)量最大，為對(duì)照的4.5 和3.6 倍。

如圖10 所示，AhLPPγ基因在9 種因素處理下均明顯誘導(dǎo)表達(dá)。AhLPPγ在4℃處理4 h 后表達(dá)量上調(diào)，8 h 下調(diào)后又逐步上調(diào)，72 h 達(dá)到最高，為對(duì)照的4.8 倍。AhLPPγ在NaCl、PEG 6000 和ABA 處理12 h后表達(dá)量明顯上調(diào)，分別為對(duì)照的37.4、4.7 和10.6倍。H2O2、JA 和ET 處理24 h，AhLPPγ基因表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照的4.7、6.3 和8.6 倍。SA 和GA 處理8 h 基因表達(dá)量最高，為對(duì)照的11.0 和4.7 倍。如圖11 所示，H2O2和JA 處理后，AhLPPδ基因表達(dá)量無(wú)變化。4℃、NaCl 和GA 處理4 h，AhLPPε基因表達(dá)量最高，為對(duì)照的2.5、6.1 和13.8 倍。PEG 6000 處理后，AhLPPδ表達(dá)量先下降后上升，72 h 表達(dá)量最高，為對(duì)照的2.3 倍。SA 和ABA 處理8 h 基因表達(dá)量最高，分別為對(duì)照的11.1 和7.7 倍。ET 處理后AhLPPδ表達(dá)量逐漸上升，24 h 表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照的3.2 倍，之后表達(dá)量逐漸下降。如圖12 所示，AhLPPε基因在9 種因素處理下均誘導(dǎo)表達(dá)。4℃、H2O2和JA 處理72 h 后，AhLPPε基因表達(dá)量為最高，分別是對(duì)照的7.5、83.3 和4.1 倍。AhLPPε表達(dá)量在NaCl、PEG 6000 和ABA 處理12 h 后最高，分別是對(duì)照的34.6、7.8 和6.3倍。SA 和GA 處理8 h 基因表達(dá)量最高，為對(duì)照的7.0 和2.8 倍。ET 處理后，AhLPPε表達(dá)量逐漸上調(diào)，24 h 表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照的13.2 倍，之后表達(dá)量逐步下降。

3 討論

LPP 在甘油脂的合成中具有重要作用。在天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)中發(fā)現(xiàn)LPPα和LPPβ兩個(gè)基因，它們編碼功能性PAP 蛋白，至少部分介導(dǎo)了DAG 的生物合成。在S.coelicolor中，LPPα或LPPβ的突變對(duì)TAG 的積累沒(méi)有影響。但是這兩個(gè)基因同時(shí)突變將會(huì)影響TAG 的從頭生物合成過(guò)程，進(jìn)而引起TAG 總量的急劇減少[23]。油棕LPPβ可能參與了油脂合成，在果實(shí)成熟時(shí)期其表達(dá)量高，與三酰甘油合成相關(guān)的?；D(zhuǎn)移酶GPAT和LPAT的表達(dá)水平一致[24]。在綠藻中過(guò)表達(dá)衣藻CrPAP2 基因或酵母ScDPP和ScLPP基因都可以顯著提高油脂含量[25-26]。

圖8 AhLPP4 基因在激素和非生物脅迫條件下的表達(dá)量分析Fig.8 Expression analysis of AhLPP4 under hormones and abiotic stresses

在植物中LPP 基因家族研究的較少，花生中該家族也鮮有報(bào)道。Kennedy 途徑將游離的脂肪酸和甘油組裝成TAG，是TAG 合成的最后一個(gè)部分，成為提高花生含油量研究的重點(diǎn)[27]。對(duì)Kennedy 途徑進(jìn)行調(diào)控是利用基因工程技術(shù)增加油脂型種子油脂含量的首選途徑。LPP 是Kennedy 途徑所需的主要酶之一。Kennedy 途徑所需的其他三種酶，甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases，GPAT)、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶 ( lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT)和二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(Acyl CoA:Diacylgycerol Acyltransferase，DGAT)，已從多種植物中被分離出來(lái)，并進(jìn)行了功能研究。因此，亟需研究植物中LPP 基因家族的功能，為研究油脂合成調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究首次從花生中分離了LPP基因，它們?cè)诨ㄉ母鱾€(gè)組織中都有表達(dá)，但表達(dá)量差異較大。其中，AhLPP1、AhLPP4、AhLPPγ、AhLPPδ、AhLPPε在花生的根中表達(dá)量最高；AhLPP2 和AhLPPβ基因在花生的下胚軸和花中表達(dá)量較高。AhLPP基因在花生種子發(fā)育初期表達(dá)量均最高，發(fā)育后期表達(dá)量下降。這些表達(dá)分析結(jié)果為進(jìn)一步研究AhLPP基因的功能提供了參考。非生物脅迫如干旱、高鹽等會(huì)使花生的產(chǎn)量大大降低[28-29]。前人報(bào)道，AtLPP1 的缺失致使擬南芥體內(nèi)PA 含量下降，導(dǎo)致植株耐鹽性下降[12]。AtLPP2 缺失突變體萌發(fā)過(guò)程中對(duì)ABA、甘露醇、高鹽等敏感[12，16]。因此，LPP基因在逆境脅迫中可能發(fā)揮了一定的作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，AhLPP基因家族對(duì)4 類非生物脅迫與5 種激素處理有不同程度的響應(yīng)，可能參與花生的逆境脅迫調(diào)控過(guò)程，其功能有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

圖9 AhLPPβ 基因在激素和非生物脅迫處理下的表達(dá)量分析Fig.9 Expression analysis of AhLPPβ under five hormones and four abiotic stresses

圖10 AhLPPγ 基因在激素和非生物脅迫處理下的表達(dá)量分析Fig.10 Expression analysis of AhLPPγ under five hormones and four abiotic stresses

圖11 AhLPPδ 基因在激素和非生物脅迫處理下的表達(dá)量分析Fig.11 Expression analysis of AhLPPδ under hormones and abiotic stresses

圖12 AhLPPε 基因在激素和非生物脅迫處理下的表達(dá)量分析Fig.12 Expression analysis of AhLPPε under five hormones and four abiotic stresses

本研究從花生葉片中克隆到了8 個(gè)LPP基因。它們都是跨膜蛋白，主要定位于質(zhì)膜上；與擬南芥AtLPP基因的序列同源性較高，具有相似的脂磷酸磷酸酶保守結(jié)構(gòu)域，可能來(lái)自于同一個(gè)祖先，且可能參與花生種子油脂合成。在5 種激素與4 類非生物脅迫處理下AhLPP2、AhLPPγ、AhLPPε基因均明顯誘導(dǎo)表達(dá)，而在4 種激素與4 類非生物脅迫處理下，AhLPPβ基因明顯誘導(dǎo)表達(dá)。AhLPP1 和AhLPPδ基因?qū)? 種激素與3 類非生物脅迫處理有響應(yīng)，而AhLPP4 基因?qū)?種激素與2 類非生物脅迫處理有響應(yīng)。本研究為進(jìn)一步闡明LPP基因家族在花生油脂合成和逆境脅迫抗性的功能奠定了理論基礎(chǔ)。