靳 叢 郭巧會 陳國棟 孫小川 孫 敏 周 瑾 王紀忠 黃小三

(1淮陰工學院，江蘇 淮安 223003； 2 南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095)

多胺(polyamines，PAs)是一類具有強生物活性的小分子量脂肪族含氮堿，廣泛存在于生物體中。高等植物中常見的多胺有腐胺(putrescine，Put)、亞精胺(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)，它們在植物生長發(fā)育和脅迫應答過程中發(fā)揮重要作用[1]。而植物體內PAs 含量變化與其合成途徑中關鍵酶所編碼基因的轉錄水平變化密切相關[2-3]。精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase，ADC)是植物在脅迫條件下形成多胺的第一個限速酶，可催化精氨酸生成Put，且此途徑是高等真核生物中植物所特有的，因此ADC 所編碼基因的結構和功能受到廣泛關注[4-5]。據(jù)報道，ADC基因屬于磷酸吡哆醛依賴性酶(pyridoxal 5’-phosphate decarboxylase，PLPDE)基因家族成員，具有家族典型的N 端Org＿Arg＿deC＿N 結構域和底物識別信號，且保守的磷酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate，PLP)結合位點可催化精氨酸脫羧，從而參與PAs 生物合成途徑[6]。

目前，已有多種植物ADC基因被克隆與表達分析，發(fā)現(xiàn)該基因在多個組織中表達，并響應不同非生物脅迫。據(jù)報道，水稻(Oryza sativa)OsADC1 和OsADC2在根、莖、葉和花序中均有表達，且受鹽、干旱和低溫脅迫誘導[7]；桃樹(Prunus perica)PpADC主要在莖、葉、花和果實中表達，并響應脫水、鹽、低溫和重金屬脅迫[8]。從顛茄(Atropa belladonna)中分離的AbADC1和AbADC2 分別在須根和主根中表達量較高，呈現(xiàn)出較明顯的組織表達特異性，且AbADC2 響應低溫脅迫[9]；金柑(Fortunella crassifolia)中的FcADC在轉錄因子FcWRKY70 的調控下通過調節(jié)Put 含量的升高，增強了轉基因煙草和檸檬的抗旱性[10]；枳(Poncirus trifoliata)PtADC基因通過清除活性氧和促進根系生長響應干旱脅迫[11]；在蓮藕(Lotus tenuis) 中過表達OatADC提高了鹽脅迫下ADC基因的轉錄水平，并通過促進脯氨酸的合成及平衡Na＋/K＋增強了耐鹽性[12]。這些研究結果表明，ADC基因在植物抵御非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

杜梨(Pyrus betulifolia)廣泛分布于我國北方地區(qū)，具有較強耐低溫、高溫、干旱和鹽堿的能力，且與栽培品種嫁接親和力強，成為應用最廣的梨砧木，是進行梨抗逆育種和基因克隆的理想材料[13-15]。本試驗以杜梨為研究材料，通過反轉錄 PCR ( reverse transcription PCR，RT-PCR)技術克隆杜梨PbADC基因全長，利用生物信息學軟件進行核苷酸和氨基酸的序列分析，結合熒光定量PCR 等方法研究PbADC基因的組織表達和對非生物脅迫的響應模式，旨在為深入探討PbADC基因功能和抗逆機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取長勢健康、一致的60 d 杜梨幼苗，分別對其進行低溫、脫水、鹽和過氧化氫的非生物脅迫處理，每個處理至少60 株幼苗，葉片隨機取樣。

1.2 脅迫處理試驗

低溫處理，將幼苗置于4℃的人工氣候室，并在0、6、12、24 和48 h 進行采樣。脫水處理，將幼苗從土中不傷根取出，并在清洗干凈根部后，放入裝有蒸餾水的燒杯中，置于溫度25℃，光周期16 h 光照/8 h 黑暗交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，將預培養(yǎng)的幼苗放在濾紙上進行脫水處理，分別在0、0.5、1、3 和6 h 進行采樣。鹽和過氧化氫處理，分別將上述預培養(yǎng)的幼苗置入200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)溶液和2% H2O2溶液中，采樣時間點為處理后0、6、12、24 和48 h。每個處理所采樣品迅速進行液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PbADC 基因及啟動子克隆

從梨基因組數(shù)據(jù)庫(http:/ /peargenome.njau.edu.cn/)獲得精氨酸脫羧酶基因ADC的基因序列，命名為PbADC，并選擇PbADC基因轉錄起始位點上游2 000 bp 左右啟動子片段，利用Primer 5.0 設計基因克隆引物PbADC-F(A T G C C G G C C C T G G C T T G T TG)和PbADC-R(AGCACAGCAATAAGACCACTGT)及啟動子克隆引物PbADC-Pro-F(TCACATAACGTAAAG TGATAAATGG)和PbADC-Pro-R(AAGGGATTAGG GTTGGGC)。分別以杜梨葉片cDNA 和DNA 為模板擴增基因和啟動子全長，PCR 反應程序均為:98℃預變性30 s；98℃變性10 s，66℃退火30 s，72℃延伸2 min，35 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后分別產(chǎn)生單一條帶的特異PCR 產(chǎn)物，膠回收后將回收產(chǎn)物與pMD 18-T(大連TaKaRa 生物工程公司)進行連接反應，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(南京擎科生物科技有限公司)，在含有100 mg·L-1的LB/Amp 固體培養(yǎng)基上進行篩選，挑選陽性克隆測序。

1.4 序列分析

利用軟件ProtParam 分析PbADC 蛋白的相對分子量和等電點，用軟件Softberry 分析亞細胞定位[16]；利用軟件Plantcare 分析啟動子順式作用元件，軟件Signal P 預測蛋白信號肽[17]；分別應用軟件SOPMA和SWISS-MODEL 預測PbADC 蛋白二級和三級結構[18]；利用軟件NetPhos 3.1 Server 和DictyOGlyc 1.1 Server 分析蛋白質修飾方式[19]；利用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 檢索PbADC 蛋白的同源序列，并使用軟件MEGA 6.0 的最大似然法(maximum likelihood，ML)進行進化樹的構建；利用軟件MEGA 6.0 和Genedoc 進行多序列比對分析；利用軟件Pfam 進行蛋白功能結構域分析[20]。

1.5 PbADC 基因表達特性分析

基于完成測序的PbADC基因序列，設計特異性表達引物PbADC-QF(GTATGCCTCCGCAGTTGTC)和PbADC-QR(GGTTCAGGTAATCGGCACG)進行基因組織表達及在多種非生物脅迫下的表達模式分析，內參基因引物為PbTublin-F(TGGGCTTTGCTCCTCTT AC)和PbTublin-R(CCTTCGTGCTCATCTTACC)[21]。利用LightCycler 480 熒光定量PCR 儀(Roche，美國)進行PbADC基因表達特性分析，反應程序為:95℃預變性5 min；94℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，45 個循環(huán)；最后72℃延伸3 min。每個樣品的檢測平行重復3 次，采用2-ΔΔCt法[22]進行定量數(shù)據(jù)計算。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Office Excel 2016 和SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析，并采用Duncan 法進行差異顯著性分析(P＜0.05)；應用Origin 9.0 軟件對數(shù)據(jù)進行整理并作圖。

2 結果與分析

2.1 PbADC 基因的克隆與序列分析

以杜梨葉片cDNA 為模板，利用特異性克隆引物擴增出目的片段，測序結果證明該片段與目的基因保持一致。PbADC開放性閱讀框(open reading frame，ORF)全長為2 190 bp，編碼730 個氨基酸(圖1)。

圖1 杜梨PbADC 基因核苷酸序列及其編碼的氨酸酸序列Fig.1 cDNA and predicted protein sequence of PbADC gene form Pyrus betulifolia

PbADC啟動子順式作用元件的預測結果顯示，除具備啟動子核心啟動元件TATA-box 和CAAT-motif外，還存在多種非生物脅迫響應相關順式作用元件，主要有厭氧響應元件(cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction，ARE)，鹽響應元件(MYB binding site in drought-inducibility，MBS)，低溫響應元件(cir-acting element involved in low-tempreture responsiveness，LTR)，干旱響應元件(inducer，injury and pathogen responses combined with WRKY trascription factors，W-box) 和 脅 迫 響 應 元 件(stress response element，STRE)等[23]，暗示PbADC可能在植物防御非生物脅迫過程中發(fā)揮一定作用。

2.2 PbADC 蛋白序列與生物活性分析

預測PbADC 蛋白質分子量約為78.53 kDa，理論等電點為5.23，不穩(wěn)定指數(shù)為42.64，親水性系數(shù)為-0.044，表明其是不穩(wěn)定親水性蛋白；信號肽分析結果表明，PbADC 不存在信號肽序列，屬于非分泌型蛋白；亞細胞定位的預測結果表明，PbADC 主要定位于細胞質中。蛋白二級結構預測結果顯示，PbADC 蛋白含有44.38%的α-螺旋，14.79%的延伸鏈，6.44%的β-轉角和34.38%的無規(guī)卷曲。利用SWISS-MODEL 軟件中的ADC 蛋白模板(PDB ID:3nzq.1.A)對PbADC 進行蛋白三級結構分析(圖2)，所構建模型與模板的序列覆蓋率達84%，氨基酸序列覆蓋范圍為53～684 位。

磷酸化和糖基化是常見的蛋白修飾方式，可能會影響蛋白的結構與功能。PbADC 蛋白磷酸化分析結果顯示，該蛋白有66 個磷酸化位點超過可能性臨界值，其中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點數(shù)量分別為44、12 和10 個，并在氨基酸序列范圍350 ～430 和610～720 部分出現(xiàn)較為密集的磷酸化位點分布(圖3)。糖基化預測分析PbADC 蛋白不存在糖基化位點。

2.3 PbADC 的氨酸酸序列同源性和進化樹分析

圖2 PbADC 蛋白的三級結構預測Fig.2 The predicted three-dimensional structure of PbADC protein

圖3 PbADC 蛋白氨酸酸序列翻譯后磷酸化修飾位點預測Fig.3 Prediction of phosphorylation site in amino acid sequence of PbADC protein

將PbADC與擬南芥(Arabidopsis thaliana，AAB09723)AtADC、枳(Poncirus trifoliata，AEE99192)PtADC、石榴(Punica granatum，XP ＿ 031390051)PgADC、棗(Ziziphus jujuba，XP＿015892431)ZjADC、甜櫻桃(Prunus avium，XP＿021806331) PaADC、桃(Prunus persica，BAG68575) PpADC 和蘋果(Malus domestica，BAD74163)MdADC 進行序列同源性分析，結果顯示氨基酸序列相似性分別為68.70%、72.46%、77.15%、77.93%、89.73%、90.14%和92.47%，表明PbADC 的氨基酸序列與這7 個物種具有較高同源性，包含完整的Orn＿Arg＿deC＿N(PF02784)結構域，并在第329～第345 殘基發(fā)現(xiàn)精氨酸脫羧酶基因家族典型的底物識別信號結構域，同時擁有保守的氨基端的賴氨酸(K)和羧基端的半胱氨酸(C)這兩個重要的酶活位點，且賴氨酸(K)殘基可能是PLP 的磷酸基結合位點(圖4)。

系統(tǒng)進化分析顯示，杜梨PbADC 與同為薔薇科的蘋果MdADC、甜櫻桃PaADC 和桃PpADC 聚為一類，親緣關系最近；與棗ZjADC、川桑MnADC 和楊梅MrADC 的親緣關系較近；與番木瓜CpADC、山茶CsADC 和擬南芥AtADC 等的親緣關系較遠(圖5)。

2.4 PbADC 基因的組織表達和非生物脅迫誘導表達分析

利用熒光定量PCR 技術對PbADC基因在杜梨根、莖和葉中的表達情況進行檢測(圖6)，結果表明，該基因在莖、根和葉中均有表達，其中在葉中表達量最高，根次之，莖中最低，呈現(xiàn)顯著的組織表達特異性。

由圖7 可知，PbADC基因的轉錄水平受低溫(4℃)、脫水、鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)和過氧化氫(2% H2O2)誘導。低溫處理過程中，PbADC的相對表達量持續(xù)升高，處理48 h 時相對表達量增加至CK 的12 倍；在脫水處理1 h 內，PbADC的相對表達水平持續(xù)升高，之后相對表達水平開始下降；鹽脅迫與H2O2處理的基因表達結果相似，都是在處理后12 h 時，PbADC的相對表達量最高，之后逐漸下降，但處理48 h 時的相對表達量仍高于CK。

3 討論

PAs 作為一種新型植物生長調節(jié)劑或“第二信使”，參與植物衰老、成花、胚胎形成、果實成熟與逆境響應等生理代謝活動[24]。ADC 是PAs 生物合成途徑中的關鍵限速酶，通常在脅迫條件下調節(jié)PAs 的含量變化。盡管已有多個ADC基因被分離，但不同物種中ADC基因的組織表達模式和非生物脅迫下的響應水平存在差異，鑒定不同植物的ADC基因將為研究該基因功能和應用奠定基礎。

本研究克隆了杜梨PbADC基因，ORF 全長2 190 bp，編碼730 個氨基酸，含有66 個磷酸化位點，高于茶樹CsADC 蛋白中的磷酸化位點數(shù)目，表明PbADC 可能在磷酸化蛋白調控過程中發(fā)揮更豐富的作用[25]。在PbADC啟動子序列中預測到的LTR 和STRE 等多種脅迫響應相關的順式作用元件也存在于響應低溫脅迫的AtADC1 啟動子中[26]，表明PbADC可能參與低溫響應；金柑轉錄因子FcWRKY70 通過特異性結合FcADC啟動子上的順式作用元件W-box，提高了ADC基因在脫水脅迫下的表達水平[10]；順式作用元件主要參與基因的表達調控，PbADC啟動子中含有上述順式作用元件，表明其與這些同源基因可能響應相似的非生物脅迫。

本研究中，蛋白序列分析顯示PbADC 含有家族保守的2-磷酸吡哆醛結合位點、PLP 磷酸基結合位點和底物識別信號，與進行比對的多個ADC 同源蛋白一致，這些是鑒定磷酸吡哆醛依賴性酶(pyridoxal 5′-phosphate decarboxylase，PLPDE)家族Ⅲ型PLPDE 亞家族成員的關鍵結構域，也是ADC基因行使功能的主要基序[27]。杜梨為薔薇科植物，本研究中系統(tǒng)進化分析顯示，PbADC 與薔薇科的蘋果MdADC、甜櫻桃PaADC 和桃PpADC 處于同一進化分支上，與棗ZjADC、川桑MnADC 和楊梅MrADC 等果樹的親緣關系也較近，表明ADC基因在進化過程中保守性較高。

圖5 PbADC 與部分物種ADC 蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of PbADC and ADC proteins from other species

圖6 不同組織中PbADC 基因的表達水平Fig.6 Expression levels of PbADC gene in different tissues

ADC基因分布于植物的多個組織中，不同植物的同源基因呈現(xiàn)明顯的組織表達特異性。本研究中的杜梨PbADC基因在葉、根和莖中都有表達，其中，在葉中的相對表達量最高，莖中的相對表達量最低。同樣在棉花中，GhADC1 基因在葉、莖和根部等組織中都有表達，而葉中基因的相對表達量最高[27]；芒果MiADC基因也被檢測到在根、莖、葉和花等組織中有表達，但在莖中的表達量高于葉中的表達量[28]；而橡膠樹HbADC1 基因在葉、雌花、雄花和樹皮等組織中都進行高量表達[29]。這種同源基因間表現(xiàn)出不同的組織表達差異可能與其參與的主要生理功能相關，也可能與PAs 的區(qū)域化分布及物種特異性有聯(lián)系。研究表明，多種植物ADC基因的轉錄水平受非生物脅迫誘導，調控腐胺含量變化，影響植物抗逆能力。ADC 蛋白通過與枳ICE1 相互作用調節(jié)PAs 水平提高抗寒性[30]；過表達AtADC2 的擬南芥具有較高的Put 含量，降低了體內H2O2的水平，增強了耐鹽性[31]；橡膠樹HbADC1 以不同表達模式響應低溫、干旱、高鹽和H2O2脅迫[29]；蘋果MdADC的轉錄水平與Put 含量呈正相關，且受低溫、脫水和鹽脅迫的誘導[32]； 枳轉錄抑制因子PtrNAC72 反向調控PtADC的表達，抑制了Put 的合成，提高了PtrNAC72 過表達株系對干旱脅迫的敏感性[33]。本研究中，杜梨PbADC參與了對低溫、脫水、鹽和H2O2的應答，表明該基因可能在杜梨響應非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。但杜梨PbADC基因抵御非生物脅迫的分子機制及不同條件下如何調控PAs的代謝，還有待進一步深入研究。

圖7 不同非生物脅迫誘導下杜梨PbADC 的相對表達模式Fig.7 Relative expression pattern of the PbADC gene under different abiotic stresses in Pyrus betulifolia

4 結論

本研究從杜梨中克隆得到精氨酸脫羧酶基因PbADC，序列分析證明該蛋白屬于磷酸吡哆醛依賴性酶(PLPDE)家族Ⅲ型PLPDE 亞家族成員，與薔薇科的蘋果、甜櫻桃和桃中的ADC 蛋白聚為一類，在杜梨葉中的表達水平最高，根次之，莖中的相對表達量最低，呈現(xiàn)顯著的組織表達特異性，受低溫、脫水、鹽和H2O2等逆境脅迫誘導，說明可能參與杜梨抵御非生物脅迫的過程。本研究結果為探討PbADC的基因功能和作用機制奠定了基礎，也為梨抗逆育種提供了思路和方向。